Titelaufnahme

Titel
Abklärung von serologisch RhD-negativen Personen, die genetisch ein D-Gen aufweisen
Weitere Titel
Investigation on serologically RhD-negative individuals, who genetically carry a D-gene
VerfasserSinger, Claudia
GutachterStöckl, Martina
Erschienen2012
Datum der AbgabeJuni 2012
SpracheDeutsch
DokumenttypBachelorarbeit
Schlagwörter (DE)partial D / weak D / DEL / Absorption/Elution / Westernblot / FACS / SSP-PCR
Schlagwörter (EN)partial D / weak D / DEL / absorption/elution / westernblot / FACS / SSP-PCR
Zugriffsbeschränkung
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Klassifikation
Zusammenfassung (Deutsch)

Sehr schwache RhD-Varianten können in der serologischen Routinediagnostik fälschlich als

RhD-negativ typisiert werden. Da Erythrozytenkonzentrate dieser Individuen ein gewisses

Immunisierungspotential bei RhD-negativen Empfängern aufweisen, führen einige

Blutspendendienste aus Qualitätssicherungsgründen auch genetische Typisierungen durch.

Diese Arbeit untersucht 20 Proben von Blutspendern mit C oder E, die serologisch mit

Routinemethoden einen scheinbar RhD negativen Phänotyp aufweisen, genetisch aber ein

RHD Gen besitzen, mit folgenden Methoden: Hämagglutinationstests, Absorption/Elution,

Westernblot, Durchflusszytometrie und SSP-PCR. Acht Proben zeigten bereits in der

Gelkarte im ICT mit drei sehr starken Anti-D Reagenzien (Seraclon/Diaclon, Anti-D weak)

eine positive Reaktion, die restlichen 12 Proben waren negativ.

Mittels der Absorption/Elution konnten keine weiteren Proben serologisch als schwach

positiv identifiziert werden. Aber die Reaktionsstärke der acht zuvor im Röhrchen lediglich

sehr schwach reaktiven Proben konnte auf 3+ oder 4+ Reaktionen verstärkt werden.

Beim Westernblot wiesen 14 Proben bei 30kDa, dem Molekulargewicht des RhD-Proteins

mit Anti-D eine Bande auf. Allerding zeigten die Positiv- und Negativkontrollen irreguläre

Reaktionen wodurch die Ergebnisse nicht verwertbar sind.

Die FACS Analyse wurde mit zwei polyklonalen und einem monoklonalen Antikörper

durchgeführt. Bei den polyklonalen Antikörpern wiesen die weak D Typen und einige partial

D Typen eine deutlich höhere Antigendichte auf als die Negativkontrolle. Bei dem

monoklonalen Antikörper zeigten 13 Proben negative Reaktionen und die weak D Typen

hatten wieder eine deutlich höhere Antigendichte als die Negativkontrolle.

Alle Proben wurden initial durch eine positive RHD-SSP-PCR, bei scheinbar negativem RhDPhänotyp,

identifiziert. Einige bekannte Ursachen für DEL-Typen, wie bestimmte

RHD/RHCE-Hybride beziehungsweise weak D-Typen, konnten bereits im Zuge dieser

initialen Testung nachgewiesen werden. Der Vollständigkeit halber wurden PCRs zum

Nachweis von vier weiteren häufigen DEL-Typen durchgeführt. Diese vier verschiedenen

Primerpaare wurden zur zusätzlichen Identifikation weiterer DEL-Allele entwickelt. Während

bei der Implementierung alle neuen Primer korrekte Reaktionen mit den Positiv- sowie

Negativkontrollen ergaben, misslang der Ansatz mit den neun zu bestimmenden Proben und

war in Bezug auf RHD (IVS3+1G>A) und weak D Typ 11 nicht verwertbar. Keine der neun

Proben dürfte allerdings den weak D Typ 4.0, 4.1 und 4.3 oder ein D Psi aufweisen.

Zusammenfassung (Englisch)

Very weak RhD-variants may be mistyped as RhD-negative. As blood units of these

individuals have a certain potential of immunizing RhD-negative recipients, some blood

establishments also apply DNA-methods for quality assurance.

In this thesis 20 samples of blood donors are examined, which show serologically a RhD

negative phenotype (with C or E) when using routine methods, but genetically have a RHD

gene. The following methods have been applied: hemagglutination tests, absorption/elution,

westernblot, flow cytometry and SSP-PCR. Eight samples show serologically a positive

reaction using very strongly reactive anti-D (Seraclon/Diaclon, anti-D weak) in the IAT in the

gel column test, twelve samples remained to show a negative reaction.

With absorption/elution methods no further samples were found to be serologically very weak

positive. But the eight already weak positive tested samples show a 3+ or 4+ positive

reaction.

In the westernblot 14 samples show a 30kDa band, this indicates that they express the RhD

protein. But the positive and negative controls show irregular reactions and so the results are

not useable.

The flow cytometry was conducted with two polyclonal antibodies and one monoclonal

antibody. With the polyclonal antibodies show the weak D types and some partial D

categories a higher antigen density than the negative control. With the monoclonal antibody

13 samples had a negative reaction and the weak D types have again a higher antigen

density than the negative control.

The SSP-PCR works with four different primer pairs. All samples are RHD (IVS3+1G>A) and

weak D type 11 positive. In each case of RHD psi and weak D type 4.0, 4.1 and 4.3 the

positive control is positive, but the samples are negative. All samples were initially identified

by a positive RHD PCR-SSP in apparently RhD negative phenotype. Some known causes of

DEL types, such as certain RHD/RHCE hybrid or weak D types were already in the course of

this initial testing demonstrated. To complete this we performed PCRs for the detection of

four other common types of DEL. These four different primer pairs were designed to further

identify additional DEL alleles. In the implementation of the new primer we show correct

responses with the positive and negative controls, but the approach failed with the nine

samples to be determined and was related to RHD (IVS3 +1 G> A) and weak D type 11 not

usable. None of the nine samples is likely to have a weak D type 4.0, 4.1 and 4.3 or a D psi.