Titelaufnahme

Titel
Aktivierung des Hitzeschock Signalwegs mittels verschiedener Stressfaktoren
Weitere Titel
Heat Shock Pathway Activation by Different Stress Factors
VerfasserEder, Noreen
Erschienen2012
Datum der AbgabeJuli 2012
SpracheEnglisch
DokumenttypBachelorarbeit
Schlagwörter (DE)Hitzeschock Signalweg / Schwermetall / Genexpressionsanalyse / qPCR / Hsp72
Schlagwörter (EN)heat shock response / heavy metal / gene expression analysis / qPCR / Hsp72
Zugriffsbeschränkung
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Klassifikation
Zusammenfassung (Deutsch)

Aktivierung des Hitzeschock Signalwegs mittels verschiedener Stressfaktoren

Der Hitzeschock (HS) Signalweg ist eine Möglichkeit für Zellen trotz extremer

Umweltbedingungen zu überleben. Dieser komplexe und vielschichtige Signalweg kann

unter anderem durch Hitze, Hypoxie, Änderungen des pH-Wertes, Infektionen, Strahlung und

Schwermetallen aktiviert werden.

Das Ziel dieser Arbeit war es den Effekt verschiedener Schwermetalle auf die Aktivierung

eines artifiziellen HS Promotor, welcher im Gegensatz zum endogenen Promotor

ausschließlich aus optimierten HS Elementen (HSE) besteht. Des Weiteren wurden

Unterschiede zwischen dem artifiziellen und dem natürlichen Promotor analysiert. Die Zellen

einer stabilen Zelllinie HEK293-pSGH2luc puro-C5, welche den artifiziellen Promotor (der die

Expression des Reportergens Luciferase (vom Leuchtkäfer) regelt) enthält, wurden

verschiedenen Schwermetallen für eine Stunde ausgesetzt und die Expression des Reportes

und die generelle Reaktion der Zelle mittels Luciferase Assay, Viability Assay und RT-qPCR

analysiert. Der Luciferase Assay wurde sechs Stunden nach der einstündigen Behandlung

für die Evaluierung der produzierten Menge an Luciferase, welche die Induktion des

artifiziellen Promotors repräsentiert, durchgeführt. Die Überlebensrate der Zellen,

24 Stunden nach der Induktion, wurden mittels einem auf Trypanblau basierenden Viability

Assay bestimmt. Die RT-qPCR zeigte die relative Menge an produzierter mRNA, welche

zwei Stunden nach der Behandlung isoliert wurde. Jedes Experiment wurde zumindest

dreimal wiederholt um statistisch relevante Daten zu erhalten. Als Positivkontrolle wurde ein

HS (43°C) durchgeführt, welche eine über 3000-fache Aktivierung des artifiziellen (Luciferase

Assay, Proteinaktivität sechs Stunden nach Induktion) und eine durchschnittlich 12-fache

Aktivierung des endogenen Promotors (RT-qPCR, mRNA Menge zwei Stunden nach

Induktion) zeigte.

Insgesamt wurden fünf Schwemetalle (Co, Cu, Ni, Hg, Pb) getestet und deren Effekte auf

den artifiziellen wie auch auf den endogenen Hsp72 Promotor analysiert. Kupfer (1 mM –

6 mM) und Quecksilber (25 µM – 150 µM) stellten sich als starke Aktivatoren beider

Promotoren heraus. Die Zellen zeigten eine maximale Induzierbarkeit bei 4 mM CuSO4

(327-fach) und bei 75 µM HgCl2 (269-fach) im Vergleich zu den uninduzierten (37°C) Zellen

beim Luciferase Assay. Die Viabilität blieb weitgehend konstant, sogar bei der nächst

höheren Konzentration nach dem Maximum (Cu: 5 mM, Hg: 100 µM), sank jedoch dann bei

6 mM CuSO4 beziehungsweise 125 mM HgCl2 stark ab. Die RT-qPCR zeigte einen

maximalen mRNA Level des natürlichen Hsp72 Promoter bei 5 mM CuSO4 (6-fach) und bei

75 µM HgCl2 (15-fach, mit jedoch nur mehr einer relativen Zellmenge von 61%). Ferner war

auch Pb(NO3)2 (2 mM – 32 mM) in der Lage beide Promotor zu aktivieren (Luciferase Assay:

12-fach, RT-qPCR: 8.5-fach, beide bei 8 mM), jedoch konnte die Viabilität nach der

Behandlung mit Blei nicht bestimmt werden (Niederschlag fiel aus als Pb(NO3)2 mit DMEM

verdünnt wurde). Zudem wurden auch CoCl2 (5 mM – 75 mM) und NiCl2 (1 mM – 300 mM)

getestet und es konnte gezeigt werden, dass beide den endogenen Promotor (4-fach bei 10

mM CoCl2, 5-fach bei 30 mM im Vergleich zu der 37°C Kontrolle) aktivieren, jedoch zeigte

der artifizielle Promotor keine Reaktion. Die Viabilität, nach der Inkubation der beiden

Schwermetalle begann bei beiden bei 30 mM zu sinken. Somit scheint die Aktivierung von

HS Genen nach einer Belastung mit Cobalt, beziehungsweise Nickel nicht nur mittels HSE

reguliert sondern eventuell mit noch anderen Elementen des natürlichen Promotors.

Keines der Schwermetalle war in der Lage die Transkription der mRNA von Luciferase

messbar zu aktivieren, obwohl teilweise deutliche Aktivierungen auf Proteinebene gemessen

werden konnten. Dies könnte durch den verschiedenen Versuchsaufbau der Experimente

erklärt werd

Zusammenfassung (Englisch)

Heat Shock Pathway Activation by Different Stress Factors

The heat shock (HS) pathway helps the cells to survive during extreme environmental

conditions. This quite complex and multistep pathway can be activated by heat, hypoxia,

changes in pH, infections, radiation, heavy metals and many other factors.

The aim of this work was to test the effect of different heavy metals on the activation of an

artificial HS promoter, which contains exclusively heat shock elements in contrast to the

endogenous promoter. Moreover, differences between the artificial and the natural promoter

were analysed. The cells of a stable cell line HEK293-pSGH2luc puro-C5, which contains the

artificial promoter driving the expression of the reporter gene firefly luciferase, were exposed

to different heavy metals for 1 h and the activation of the reporter and the general response

of the cells were analysed with a luciferase assay, viability assay and RT-qPCR. The

luciferase assay was performed 6 hours after the one hour treatment and was used to

evaluate the produced amount of luciferase which represents the activity of the artificial

promoter. The death rate of the cells, 24 hrs after induction, was tested with a Trypan blue

based viability assay. The RT-qPCR showed the relative levels of mRNA isolated 2 hrs after

treatment. Each experiment was performed at least in triplicates to get statistically relevant

data. As a positive control a HS (43°C) was performed, which showed a more than 3000-fold

induction of the artificial promoter (luciferase assay, protein activity 6 hrs after induction) and

an average 12-fold increase of mRNA of the endogenous promoter (RT-qPCR, mRNA levels

2 hrs after induction).

Five heavy metals (Co, Cu, Ni, Hg, Pb) were tested and their effects on the artificial as well

as an endogenous Hsp72 promoter were analysed. Copper (1 mM – 6 mM) and mercury

(25 µM – 150 µM) turned out to be strong inducers of both promoters. The cells showed a

maximum inducibility at 4 mM CuSO4 (327-fold) and at 75 µM HgCl2 (269-fold) in comparison

to the uninduced cells (37°C) using the luciferase assay. The viability was unaffected even at

higher concentrations following the maximum induction (Cu: 5 mM, Hg: 100 µM) but started

to decrease rapidly at concentrations of 6 mM CuSO4 and 125 mM HgCl2. The RT-qPCR

showed peak mRNA levels of the endogenous Hsp72 promoter at 5 mM CuSO4 (6-fold) and

at 75 µM HgCl2 (15-fold, but at this point the relative amount of measured cells was already

reduced to 61%). In addition, Pb(NO3)2 (2 mM – 32 mM) was able to induce both promoters

(luciferase assay: 12-fold, RT-qPCR: 8.5-fold, both at 8 mM), but due to experimental

problems, the viability after lead exposure could not be tested (a precipitate was formed,

while Pb(NO3)2 was diluted with DMEM). Furthermore, CoCl2 (5 mM – 75 mM) and NiCl2 (1

mM – 300 mM) were tested and could be shown to activate the natural promoter (4-fold at 10

mM CoCl2, 5-fold at 30 mM NiCl2 compared to the 37°C control), but they showed no

reaction of the artificial promoter. The viability after incubation with these two heavy metals

started to decrease for both heavy metals at 30 mM. So the activation of the HS genes after

exposure to cobalt and nickel does not seem to be regulated via HSE but additional

regulatory elements present in the natural promoters.

The luciferase reporter is extremely sensitive. Therefore, either no or only weak increases of

the mRNA levels were detectable by RT-qPCR for heavy metal exposure, although strong

signals could be detected in the luciferase acitivity assay. This can be explained due to the

different setup of the experiments. The activity of luciferase protein was determined 6 hrs

after heavy metal stress treatment and the mRNA levels were analysed already 2 hrs after

treatment. The setup for the two assays was optimized for analysing the response to heat

treatment, so it migh