Titelaufnahme

Titel
Mss116p-induzierte Faltung des bI5 Gruppe I Introns
Weitere Titel
Mss116p-induced Folding of Group I Intron bI5
AutorInnenHandl, Stefan
Erschienen2012
Datum der AbgabeJuli 2012
SpracheDeutsch
DokumenttypBachelorarbeit
Schlagwörter (DE)bI5 / Gruppe I Intron / Mss116p / DMS Modifikation / RNA Faltung
Schlagwörter (EN)bI5 / group I intron / Mss116p / DMS chemical probing / RNA-folding
Zugriffsbeschränkung
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Klassifikation
Zusammenfassung (Deutsch)

Mss116p-induzierte Faltung des bI5 Gruppe I Introns

bI5 ist ein autokatalytisches Gruppe I Intron in den Mitochondrien von S. cerevisiae. In vitro kann dieses Intron bei nicht-physiologischen Metallionen Bedingungen effizient spleißen. Dieser Spleißmechanismus entspricht einer 2-Schritt trans-Esterifizierung bei der das Intron diese Reaktion in linearisierter Form verlässt und die Exons werden ligiert. Bei nahe-physiologischen MgCl2-konzentration benötigt bI5 ein Co-Faktor-Protein, CBP2 (cytochrome pre-mRNA procesing Protein 2) zur Stabilisierung der Intronstruktur. Dabei bringt CBP2 das Intron in eine spezifische räumliche Anordnung, um so die korrekte und spleißkompetente Faltung zu begünstigen. Interessanterweise benötigt bI5 in vivo noch einen weiteren Co-Faktor, Mss116p, welches eine DEAD-Box Helikase ist, um effizient zu spleißen. Mss116p stimuliert in vivo das Spleißen von Gruppe I und II Introns Hefe, weshalb Mss116p knockout Stämme auf Nährböden mit nicht fermentierbaren Kohlenstoffquellen nicht wachsen können. Das Ziel dieser Bachelorarbeit ist die erste Untersuchung der Mss116p induzierten Faltung des Gruppe I Introns bI5 in vitro. Zunächst wird rekombinantes Mss116p produziert und dessen Aktivität mittels ATPase assay überprüft. Dabei wurde festgestellt, dass die ATP Hydrolyse in Anwesenheit von bI5 in etwa der gleichen Aktivität in der Anwesenheit von ai5? entspricht. Dann wird mithilfe von DMS chemical probing die Änderung der bI5 Konformation in An- und Abwesenheit von Mss116p festgestellt und gezeigt, dass strukturell wichtige Elemente zugänglicher für/oder besser geschützt vor DMS Modifizierungen sind. Die vorläufigen Daten weisen daraufhin, dass die bI5 Struktur in Anwesenheit von Mss116p generell offener ist und sich keine Tertiärstruktur ausbilden kann. Des Weiteren zeigen diese Daten, dass die Faltung von bI5 unter nicht-physiologischen MgCl2-Konzentrationen stärker in den nativen und spleiß kompetenten Zustand bringen, dadurch sind viele Nukleotide geschützter vor DMS Modifizierungen. Mss116p nach den vorliegenden Daten die Konformation von bI5 an einigen Stellen (P11, P10) zu lockern und diese an anderen Stellen (P3) in den nativ gefalteten Zustand zu bringen scheint. Weitere Ergebnisse sind notwendig, um auf die Art und Weise sowie den Mechanismus dieser Mss116p induzierten Konformationsänderung von bI5 zu schließen.

Zusammenfassung (Englisch)

Mss116p-induced folding of group I intron bI5

bI5 is an autocatalytic group I intron which is located in the mitochondria of S. cerevisiae. In vitro the intron splices efficiently under non-physiological metalion conditions. The splicing mechanism is a 2-step trans-esterification, which the intron exits in linearized form and the exons are ligated. At near-physiological MgCl2-concentration the intron needs a cofactor, CBP2 (cytochrome pre-mRNA processing protein 2) for structural stabilization. To achieve this CBP 2 promotes the formation of the correct, native three-dimensional bI5 conformation. Interestingly, in vivo the intron needs another cofactor, Mss116p, which is a DEAD-Box helicase for efficient splicing. In vivo Mss116p stimulates splicing of group I and II Introns in yeast mitochondria, because Mss116p deficient strains are not able to grow on non-fermentable carbon sources. The aim of this bachelor thesis is to take a first look on the Mss116p induced structural changes within the group I intron bI5 in vitro. For this, recombinant Mss116p has to be produced and its ATPase activity was tested with an assay. This assay shows that bI5stimulates the hydrolysis of ATP by Mss116p in a comparable manner, as the ai5?/Mss116p complex did. Afterwards Mss116p-induced conformational changes within bI5 were studied with DMS chemical probing, revealing that residues within important structural elements become more or less accessible to DMS in the presence of Mss116p. Current data show that the bI5 structure in presence of Mss116p is in general more open and not able to form its tertiary structure. Furthermore these data show that the folding of bI5 at non-physiological metal ion conditions brings the intron into a correct, splicing-kompetent conformation and so certain elements are protected for DMS modifications. In conclusion, the given data suggest that Mss116p changes the conformation of bI5 in a way that it opens certain elements (P11, P10) but on the other hand other elements (P3) can form. Additional experiments are necessary to explore the mechanism underlying this Mss116p induced conformational changes within bI5 group I intron.

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