Titelaufnahme

Titel
Effizienz von DNA-Transfektionen in Säugerzellen - Ein Vergleich verschiedener Methoden
Weitere Titel
Efficiency of DNA-Transfection in Mammalian Cells - a Comparison of Different Methods
VerfasserHarold, Karin
Erschienen2012
Datum der AbgabeJuli 2012
SpracheEnglisch
DokumenttypBachelorarbeit
Schlagwörter (DE)Transfektions-Effizienz Profilin-Citrine Lipofektion Serum
Schlagwörter (EN)Tranfection-Efficiency Lipofection Profilin-Citrine Serum
Zugriffsbeschränkung
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Klassifikation
Zusammenfassung (Deutsch)

Kurzfassung: Efficiency of DNA-Transfection in mammalian cells – A comparison of methods

Bachelorarbeit II, eingereicht von Karin Harold

Diese Arbeit befasst sich mit DNA-Transfektion durch die Methode der Lipofektion. Ziel der Arbeit war es, die Transfektions - Effizienz zweier unterschiedlicher Protokolle für Lipofektion mithilfe des Reagens Lipofectamine™2000 der Firma Invitrogen zu vergleichen, welche jeweils an zwei unterschiedlichen Zelllinien durchgeführt wurde.

Da mein Gast-Labor im Gebiet der Zellbiologie tätig ist und sich mit dem Mikrofilament-System und im Besonderen mit dem Actin-Netzwerk und dem Actin-bindenden Protein Profilin beschäftigt, war das zu transfizierende Protein ein Fusionskonstrukt von Profilin mit Citrine, einer gelb fluoreszierenden Mutante von EGFP.

Dieses Konstrukt wurde durch vorher gehende Arbeit im Labor erstellt und auf Expression und Funktion getestet. Die Insertionsstelle des Citrine scheint laut diesen bereits vorhandenen Ergebnissen nicht die natürliche Funktion des Profilin zu beeinträchtigen.

Allerdings lag dennoch ein Augenmerk auf die Verteilung des Fusionskonstruktes in der Zelle, da eine unnatürliche Akkumulation während der vielen Beobachtungen im Fluoreszenzmikroskop aufgefallen wäre.

Das Hauptaugenmerk lag jedoch auf der Transfektions-Effizienz der beiden zu vergleichenden Protokolle für Lipofektion mittels Lipofectamine™2000. Diese beiden Protokolle folgen beinahe den gleichen Schritten und unterscheiden sich nur in der Anwesenheit von Serum während der Inkubation der Zellen mit dem Transfektions-Reagens und der Anwesenheit von Antibiotikum in der späteren Inkubation bis zur Fixation.

Die verwendeten Zelllinien waren B16 (murine kanzerogene Fibroblasten) und C2C12 (murine skeletale Myoblasten), da diese beiden Zelllinien die am häufigsten gebrauchten Zellen in meinem Gastlabor waren.

Die Transfektions-Effizienz wurde mittels Fluoreszenzmikroskopie ermittelt, indem die Zellen fixiert und mit Phalloidin-TRITC gefärbt wurden (welches an Actin-Filamente bindet und somit diese rot fäbrt). Danach wurde die Gesamtanzahl der Zellen mit der Anzahl der transfizierten Zellen (welche als gelb fluoreszierend sichtbar sind, da sie Citrine exprimieren) verglichen und die Transfektions-Effizienz ermittelt.

Die daraus resultierenden Ergebnisse wurden noch mittels Western Blotting bestätigt. Die Ergebnisse zeigten, dass das Protokoll, welches kein Serum während der Inkubation mit dem Transfektionsreagens verwendet, in beiden Zelllinien wesentlich effektiver ist.

Dies rührt daher, dass die im Serum enthaltenen Lipide mit den im Transfektionsreagens enthaltenen Lipiden interagieren und so die Transfektion stören und die DNA nicht in die Zelle eingebracht werden kann.

Zusammenfassung (Englisch)

Short description: Efficiency of DNA-Transfection in mammalian cells – A comparison of methods

by Karin Harold

This thesis deals with the transfection efficiency of DNA-transfection in mammalian cells. The used method for transfection was lipofection through the reagent Lipofectamine™2000 by Invitrogen. Transfection was performed according to two different protocols, which differ in the presence of serum during the incubation with the transfection reagent and the presence of antibiotics during the later incubation until fixation. Transfection was performed on two different cell lines, which were cancerous mouse fibroblasts (B16) and mouse skeletal myoblasts (C2C12). Those cell lines were chosen because they are the most common cell lines within my host laboratory.

As my host laboratory deals with the microfilament system, especially the actin networks and the actin-binding protein profilin, the plasmid used for transfection encoded for a fusion protein of profilin with citrine, a yellow fluorescent mutant of EGFP. Therefore further interest was given to the expression and distribution of this fusion construct within the cells, as former work has shown that the insertion of citrine at the given position does not interfere with any known binding sites of profilin.

Transfection efficiency was calculated through counting the total number of cells and the number of transfected cells. This was possible as all cells were stained with Phalloidin-TRITC (binds to actin filaments and stains them red) after fixation. The positively transfected cells could be seen through the yellow fluorescence of the fusion construct.

The results show in general a better transfection efficiency for B16 than for C2C12. The comparison of the two different protocols for lipofection showed, that the one without serum during the incubation with the transfection reagent was more effective. This comes along with former findings, which show that the lipids contained in the serum interfere with the lipids contained in the transfection reagent, which results in lesser transfection efficiency (Son et al 2001, Audouy et al 2000; for full reference see thesis).