Titelaufnahme

Titel
Subklonierung von immunogenen SEREX cDNA-Klonen zum Testen von Brustkrebs Autoantikörpern
Weitere Titel
Sub-cloning of Immunogenic Serex-derived cDNA Clones for Breast Cancer Auto-antibody Testing
VerfasserHein, Dominic
Erschienen2012
Datum der AbgabeJuli 2012
SpracheEnglisch
DokumenttypBachelorarbeit
Schlagwörter (DE)SEREX / Sub-Klonierung / cDNA Bibliothek / Brustkrebs / Tumor Autoantikörper
Schlagwörter (EN)SEREX / sub-cloning / cDNA library / breast cancer / tumour autoantibodies
Zugriffsbeschränkung
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Klassifikation
Zusammenfassung (Deutsch)

Kurzfassung

Mittels serologischer Identifikation von Antigenen wurde durch rekombinante Expression (SEREX), eine Sammlung von Klonen erstellt, welche aus den Tumoren von Brustkrebspatientinnen gewonnen wurden. Ausgehend von diesen 186 SEREX Klonen, wurden aus deren Inserts, welche den kodierenden Tumor-auto-Antigenen entsprechen, cDNA Sequenzen durch Polymerase Kettenreaktion (PCR) gewonnen. Hierfür wurden 2 unterschiedliche Strategien angewendet. Für alle 60 „in-frame-clones“ (IFC) wurden 2 primer hergestellt, welche die erforderlichen Restriktionsschnittstellen aufwiesen. Im Gegensatz zu den 126 „out-of-frame-clones“, bei welchen der vorwärts Primer auf dieselbe Weise erstellt wurde wie bei den IFC, jedoch die rückwärts Primer für jeden Klon spezifisch und individuell designt wurden. Nach einem 2fachen Verdau mit den entsprechenden Restriktionsenzymen, wurden die prozessierten und aufgereinigten Inserts in einen 6fach markierten Vektor (pQE30NST) ligiert. Die Konstrukte wurden in kompetente Zellen E.coli XL1-Blue-MRF transformiert und ausplattiert. Einzel Kolonien wurden entnommen und eine übernacht Kultur wurde angesetzt, für einen Glycerol-Stock und eine Plasmid Isolierung. Mittels Sequenz Analyse der ersten 60 Klone wurde festgestellt, dass bei 36 Konstrukten die Sub-Klonierung erfolgreich war. Die Klone wurden auf 96well Platten kultiviert und deren Proteine mittels Autoinduktion exprimiert. Die Produkte wurden durch Ni-NTA Affinitäts-Chromatographie gereinigt und die Expression durch Sodium Dodecyl Sulfat Polyacrylamid Gel Elektrophorese (SDS-PAGE) überprüft. Folglich wurden 72 Klone exprimiert für die Herstellung von Mikroarrays. Basierend auf Tumor-Autoantikörpern werden die zukünftigen Mikroarrays ausgewertet, um als Biomarker, mit geringem Volumen an Serum, zur Früherkennung, bei Brustkrebs Patientinnen zu dienen.

Zusammenfassung (Englisch)

Abstract

In terms of serological identification of antigens by recombinant expression of cDNA (SEREX) a clone library was prepared from tumours of breast cancer patients and tested with autologous sera. Starting from these 186 SEREX clones, vector inserts for the encoded tumour auto-antigen, cDNA sequences were amplified by polymerase chain reaction (PCR). Two different strategies were used for 60 in-frame-clones (IFC) and 126 out-of-frame-clones (OOFC). For the IFC 2 primers, containing the appropriate restriction sites, were designed. The OOFC were processed with a forward primer, constructed similar as for the IFC, though the reverse primers were designed individually for each clone. After double digestion with appropriate restriction enzymes, the processed and purified inserts were ligated into a histidine-(6x)-tagged vector (pQE30NST). The products were transformed into competent E. coli XL1-Blue-MRF cells and plated. Single colonies were picked and grown over night for glycerol stock and plasmid isolation. From these, 60 constructs were sequenced. The analysis showed that 36 were successfully sub-cloned. The clones were cultured onto 96well plates and the proteins were expressed via auto-induction. The products were purified by a nickel-NTA affinity chromatography and to monitor protein expression, sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) was accomplished. Thus 72 expression clones have been generated, before sequence analysis, for protein microarray generation. These microarrays will then be evaluated for tumour autoantibody based early breast cancer diagnostics using minimal amounts of serum.