Titelaufnahme

Titel
Interaktion von FOXP3 exprimierenden Zellen mit T-Zellen
Weitere Titel
Interaction of FOXP3 expressing cells with T cells
VerfasserJutz, Sabrina
Erschienen2012
Datum der AbgabeAugust 2012
SpracheEnglisch
DokumenttypBachelorarbeit
Schlagwörter (DE)Tregs / FOXP3 / Artifizielle Antigen-präsentierende Zellen / Bw5147 Zellen / T-Zell-Aktivierung
Schlagwörter (EN)Tregs / FOXP3 / Artificial antigen presenting cells / Bw5147 cells / T-cell activation
Zugriffsbeschränkung
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Klassifikation
Zusammenfassung (Deutsch)

Interaktion von FOXP3-exprimierenden Zellen mit T-Zellen

FOXP3 ist ein Transkriptionsfaktor, der für die Entwicklung und Funktion von regulatorischen T-Zellen benötigt wird. Regulatorische T-Zellen sind für die Aufrechterhaltung eines gesunden Immunsystems wichtig, da nachgewiesen wurde, dass sie eine Rolle bei der Verhinderung von Allergien, Autoimmunerkrankungen, Transplantats-Abstoßungen und Graft-versus-Host-Erkrankungen spielen, indem sie autoreaktive Lymphozyten unterdrücken. Eine Überexpression von FOXP3 in naiven T-Zellen führt zur Entwicklung von regulatorischen T-Zellen. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass die Expression in dendritischen Zellen diesen einen suppressiven Phänotyp verleiht.

Da regulatorische T-Zellen in vitro hypoproliferativ sind, ist ihre Kultivierung schwierig, was in-vitro-Studien zu ihrer Funktion erschwert. Das Ziel dieser Arbeit war, ein System zu etablieren, bei dem Zellen mit einem regulatorischen Phänotyp einfach und unbegrenzt kultiviert werden können. Deshalb wurde eine Antigen-präsentierende Zelllinie, die unbegrenzt expandiert werden kann, entwickelt, die murines FOXP3 stabil exprimiert. In einem ersten Schritt wurden Antigen-spezifische murine T-Zell-Stimulatoren (AS-mTCS) hergestellt, indem Antigen-Peptide und MHC-I-Moleküle in Bw5147 Zellen exprimiert wurden, um Antigen-MHC-I-Komplexe zu bilden. In einem zweiten Schritt wurde murines FOXP3 (mFOXP3) in diesen AS-mTCS exprimiert. Aufgrund des hypoproliferativen Zustands von regulatorischen T-Zellen in vitro könnte eine konstante Expression von mFOXP3 wenig oder kein Zellwachstum zur Folge haben. Aus diesem Grund wurde ein induzierbares Expressionssystem verwendet. Die erzeugten mFOXP3-exprimierenden AS-mTCS sollten durch die Expression des Antigen-Peptid-MHC-I Komplexes und mFOXP3 Eigenschaften von Antigen-präsentierenden Zellen und regulatorischen T-Zellen aufweisen. Dieses AS-mTCS-System wurde charakterisiert und es wurde untersucht, ob die Expression in einer Suppression von Responder-T-Zellen resultiert.

Für die Generierung von AS-mTCS wurden Bw-Zellen mit H-2Db, dem Restriktionselement für P14-TCR-transgene T-Zellen, transduziert. Diese P14-TCR-transgenen T Zellen, die aus C5Bl6 L327 Mäusen isoliert wurden, exprimieren einen TCR, der spezifisch für das Lymphozytäre-Choriomeningitis-Virus-Glycoprotein (LCMV-gp) Epitop 33-41 mit der Peptidsequenz KAVYNFATM (Abkürzung in dieser Arbeit: FATM) ist, das durch H-2Db präsentiert wird. Drei verschiedene Ansätze wurden entwickelt, um FATM-präsentierende Bw-Db-Zellen zu generieren. Von den drei generierten AS-mTCS erzeugten wir zudem Stimulatorlinien mit einer hohen Expression des murinen Costimulator-Moleküls CD80 (mCD80). Die Expression von H-2Db, LCMV-gp und mCD80 auf den AS-mTCS wurde durch eine durchflusszytometrische Analyse bestätigt. Proliferationsassays ergaben, dass alle generierten AS-mTCS in der Lage waren, Antigen-spezifische P14-Splenocyten zu stimulieren. Bw-H-2Db Zellen, die kein Antigen-Peptid präsentieren, riefen hingegen keine Proliferation in P14-Splenocyten hervor. Darüber hinaus wurde die Proliferation in allen Systemen stark erhöht, wenn P14-Splenocyten mit Signal 1 und 2 in Form von mCD80 exprimierenden AS-mTCS stimuliert wurden. Von diesen generierten AS-mTCS-Systemen wurden zwei für weitere Versuche verwendet.

Für die Entwicklung von mFOXP3-exprimierenden AS-mTCS wurde mFOXP3 PCR-amplifiziert, unter Verwendung von cDNA, die aus RNA von EL-4 Zellen synthetisiert wurde. mFOXP3 wurde anschließend in einen bicistronischen HRI-GFP sowie einen monocistronischen HRI-Vektor kloniert. Diese zwei Konstrukte wurden in die zwei ausgewählten AS-mTCS transduziert und phänotypisch mittels Durchflusszytometrie charakterisiert. Die durchflusszytometrische Analyse von mFOXP3-exprimierenden AS-mTCS ergab, dass mFOXP3 in diesen hoch exprimiert ist. Wachstums- und Expressionskinetik-Studien wurden durchgeführt, um die Expression von mFOXP3 und die Wirkung der Doxycyclin-Be

Zusammenfassung (Englisch)

Interaktion von FOXP3-exprimierenden Zellen mit T-Zellen

FOXP3 ist ein Transkriptionsfaktor, der für die Entwicklung und Funktion von regulatorischen T-Zellen benötigt wird. Regulatorische T-Zellen sind für die Aufrechterhaltung eines gesunden Immunsystems wichtig, da nachgewiesen wurde, dass sie eine Rolle bei der Verhinderung von Allergien, Autoimmunerkrankungen, Transplantats-Abstoßungen und Graft-versus-Host-Erkrankungen spielen, indem sie autoreaktive Lymphozyten unterdrücken. Eine Überexpression von FOXP3 in naiven T-Zellen führt zur Entwicklung von regulatorischen T-Zellen. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass die Expression in dendritischen Zellen diesen einen suppressiven Phänotyp verleiht.

Da regulatorische T-Zellen in vitro hypoproliferativ sind, ist ihre Kultivierung schwierig, was in-vitro-Studien zu ihrer Funktion erschwert. Das Ziel dieser Arbeit war, ein System zu etablieren, bei dem Zellen mit einem regulatorischen Phänotyp einfach und unbegrenzt kultiviert werden können. Deshalb wurde eine Antigen-präsentierende Zelllinie, die unbegrenzt expandiert werden kann, entwickelt, die murines FOXP3 stabil exprimiert. In einem ersten Schritt wurden Antigen-spezifische murine T-Zell-Stimulatoren (AS-mTCS) hergestellt, indem Antigen-Peptide und MHC-I-Moleküle in Bw5147 Zellen exprimiert wurden, um Antigen-MHC-I-Komplexe zu bilden. In einem zweiten Schritt wurde murines FOXP3 (mFOXP3) in diesen AS-mTCS exprimiert. Aufgrund des hypoproliferativen Zustands von regulatorischen T-Zellen in vitro könnte eine konstante Expression von mFOXP3 wenig oder kein Zellwachstum zur Folge haben. Aus diesem Grund wurde ein induzierbares Expressionssystem verwendet. Die erzeugten mFOXP3-exprimierenden AS-mTCS sollten durch die Expression des Antigen-Peptid-MHC-I Komplexes und mFOXP3 Eigenschaften von Antigen-präsentierenden Zellen und regulatorischen T-Zellen aufweisen. Dieses AS-mTCS-System wurde charakterisiert und es wurde untersucht, ob die Expression in einer Suppression von Responder-T-Zellen resultiert.

Für die Generierung von AS-mTCS wurden Bw-Zellen mit H-2Db, dem Restriktionselement für P14-TCR-transgene T-Zellen, transduziert. Diese P14-TCR-transgenen T Zellen, die aus C5Bl6 L327 Mäusen isoliert wurden, exprimieren einen TCR, der spezifisch für das Lymphozytäre-Choriomeningitis-Virus-Glycoprotein (LCMV-gp) Epitop 33-41 mit der Peptidsequenz KAVYNFATM (Abkürzung in dieser Arbeit: FATM) ist, das durch H-2Db präsentiert wird. Drei verschiedene Ansätze wurden entwickelt, um FATM-präsentierende Bw-Db-Zellen zu generieren. Von den drei generierten AS-mTCS erzeugten wir zudem Stimulatorlinien mit einer hohen Expression des murinen Costimulator-Moleküls CD80 (mCD80). Die Expression von H-2Db, LCMV-gp und mCD80 auf den AS-mTCS wurde durch eine durchflusszytometrische Analyse bestätigt. Proliferationsassays ergaben, dass alle generierten AS-mTCS in der Lage waren, Antigen-spezifische P14-Splenocyten zu stimulieren. Bw-H-2Db Zellen, die kein Antigen-Peptid präsentieren, riefen hingegen keine Proliferation in P14-Splenocyten hervor. Darüber hinaus wurde die Proliferation in allen Systemen stark erhöht, wenn P14-Splenocyten mit Signal 1 und 2 in Form von mCD80 exprimierenden AS-mTCS stimuliert wurden. Von diesen generierten AS-mTCS-Systemen wurden zwei für weitere Versuche verwendet.

Für die Entwicklung von mFOXP3-exprimierenden AS-mTCS wurde mFOXP3 PCR-amplifiziert, unter Verwendung von cDNA, die aus RNA von EL-4 Zellen synthetisiert wurde. mFOXP3 wurde anschließend in einen bicistronischen HRI-GFP sowie einen monocistronischen HRI-Vektor kloniert. Diese zwei Konstrukte wurden in die zwei ausgewählten AS-mTCS transduziert und phänotypisch mittels Durchflusszytometrie charakterisiert. Die durchflusszytometrische Analyse von mFOXP3-exprimierenden AS-mTCS ergab, dass mFOXP3 in diesen hoch exprimiert ist. Wachstums- und Expressionskinetik-Studien wurden durchgeführt, um die Expression von mFOXP3 und die Wirkung der Doxycyclin-Be