Titelaufnahme

Titel
Charakterisierung des Sequenz-Spezifischen Rekombinationssystems der Prophage Eco-6
Weitere Titel
Characterization of the Site-Specific Recombination System of Prophage Eco-6
VerfasserKienbeck, Kasimir
Erschienen2012
Datum der AbgabeSeptember 2012
SpracheEnglisch
DokumenttypBachelorarbeit
Schlagwörter (DE)temperente Coliphage / Caudovirales / Myoviridae / Peduovirinae / Eco-6 / P2 ähnliche Phage / Phagen Integrase / Tyrosin Rekombinase / Site spezifische Rekombination / Bakteriophagen Therapie / Gentherapie
Schlagwörter (EN)temperate coliphage / Caudovirales / Myoviridae / Peduovirinae / Eco-6 / P2-like phage / phage integrase / tyrosine recombinase / site-specific recombination / bacteriophage therapy / gene therapy
Zugriffsbeschränkung
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Klassifikation
Zusammenfassung (Deutsch)

Charakterisierung des Site Spezifischen Rekombinationssystems der Prophage Eco-6

Das Ziel dieser Arbeit ist es, die Integrase der Bakteriophage PhiEco-6 auf Funktionalität zu untersuchen und zu charakterisieren. Diese P2 ähnliche temperente Coliphage wurde in dem pathogenen Stamm Escherichia coli 101-1 als Prophage identifiziert und gehört zur Ordnung der Caudovirales, Familie Myoviridae und Subfamilie Peduovirinae. Sie hat ein Genom bestehend aus linearer dsDNA, umhüllt von einem ikosahedralen Capsid verbunden mit einem Schwanz mit einfahrbarer Hülle.

Die PhiEco-6 Integrase ist eine site spezifische, direkte Rekombinase, welche sehr vielversprechend als Werkzeug für Gentherapie am unmodifizierten menschlichen Genom zu sein scheint, da die meisten Nachteile anderer aktueller Werkzeuge nicht auf sie zutreffen. Beispielsweise wird die Integration zwar reversibel durchgeführt, aber für den Umkehrprozess wird ein zusätzlicher, phagenkodierter Faktor (control of excision, Cox) benötigt. In der Abwesenheit von Cox geschieht eine irreversible Integration des Phagengenoms in eine spezifische bakterielle Erkennungssequenz attB. Weitere Nachteile, wie etwa die einer zufälligen Integration, mit der Gefahr der Unterbrechung von bestehenden Genen durch Integration in kodierende Regionen, einer Undirektionalität, wobei das Gen zufällig in beide möglichen Orientierungen integriert wird, oder "gene-hopping" durch reversible Integration könnten durch den Gebrauch von PhiEco-6 Integrase vermieden werden. Nach der Integration bilden sich zwei eindeutige Sequenzen, attL und attR, wodurch diese gerichtet abläuft. Zusätzlich dazu ist die kurze und einfache Erkennungssequenz der PhiEco-6 Integrase fast identisch mit zwei Sequenzen in den menschlichen Chromosomen 11 (Pseudo-attB, 19 von 20 Basen ident) und X (Pseudo-2attB, 18 von 20 Basen ident).

Die rekombinative Aktivität der PhiEco-6 Integrase wird mittels bakteriellem in vivo Rekombinations Assay in Escherichia coli nachgewiesen. Ihre Funktionalität wird zuerst erfolgreich mit der wildtyp Erkennungssequenz attB und anschließend mit den mutierten menschlichen Sequenzen Pseudo-attB und Pseudo-2attB als Substrate nachgewiesen. Pseudo-2attB zeigt sogar eine Verdopplung der rekombinativen Aktivität, eine Eigenschaft, welche diese Sequenz sehr attraktiv für mögliche zukünftige Verwendung macht.

Für die weitere Charakterisierung werden die für die Rekombination essentiellen Basen sowohl im vermuteten Überlappungsbereich zwischen attB und der Phagen Erkennungssequenz attP als auch in den vermuteten Integrasen Bindungsstellen, den flankierenden "inverted repeats", nachgewiesen. Dies geschieht durch das Einführen von gezielten Punktmutationen in die attB site mittels ortsspezifischer Mutagenese (SDM) und das anschließende Untersuchen der rekombinativen Aktivität. Um zwischen dem Überlappungsbereich und den Integrasen Bindungsstellen zu unterscheiden, werden kompensierende Punktmutationen in die attP site eingeführt, um zu sehen ob die Aktivität wiederhergestellt wird.

Diese Arbeit zeigt, dass die PhiEco-6 Integrase großes Potential als ein zukünftiges Werkzeug für die Gentherapie am Menschen aufweist, was das allgemeine Interesse an dieser und/oder anderen P2 ähnlichen Rekombinasen weckt.

Zusammenfassung (Englisch)

Characterization of the Site-Specific Recombination System of Prophage Eco-6

The aim of this work is to characterize and test the functionality of the integrase of PhiEco-6, a P2-like temperate coliphage. It was identified as a prophage in the pathogenic strain Escherichia coli 101-1 and belongs to the order of the Caudovirales (tailed phages), family Myoviridae and subfamily Peduovirinae. Its genome consists of linear dsDNA surrounded by an icosahedral capsid and an attached tail with a contractile sheath.

PhiEco-6 integrase is a site-specific, directed recombinase which seems very promising as a possible tool for gene therapy in the unmodified human genome, as most of the disadvantages of current tools do not apply for it. For example, the integration is performed reversibly, but an additional, phage-encoded factor (control of excision, Cox) is required for excision. In the absence of Cox, the integrase performs an irreversible integration of the phage genome into a specific bacterial attachment site attB. Further disadvantages such as random integration with the danger of disrupting genes by integration into coding regions, undirectionality, where the gene is inserted randomly in both possible directions, or gene-hopping by reversible integration may be avoided by using PhiEco-6 integrase. Upon integration, two host-phage junctions, attL and attR, are formed, making the integration directed. Additionally, the short and simple attB site of PhiEco-6 integrase is almost identical to two sequences in non-coding regions of the human chromosome 11 (pseudo-attB, 19 out of 20 bases identical) and the X chromosome (pseudo-2attB, 18 out of 20 bases identical).

The recombinational activity of PhiEco-6 integrase is proven by means of a bacterial in vivo recombination assay system in Escherichia coli. Its functionality is first successfully tested with the wild-type attachment substrate attB and then with the attachment site mutated to the human sequences pseudo-attB and pseudo-2attB. Pseudo-2attB even shows a recombination efficiency twice as high as the wild-type substrate, making it very attractive for possible future uses.

For further characterization, the bases essential for recombination are determined in the predicted overlap region between attB and the phage attachment site attP as well as the flanking inverted repeats (predicted integrase binding sites). This is done by introducing single point mutations into the attB site by means of site-directed mutagenesis (SDM) and testing the effect on the recombination efficiency. To distinguish between the overlap region and the integrase binding regions, compensatory mutations are introduced into the attP site to see if the recombination efficiency is restored.

This work shows that PhiEco-6 integrase has a great potential of becoming a future tool for gene therapy in humans and supports the interest in this and/or other P2-like recombinases.