Titelaufnahme

Titel
Immunphänotypisierung von disseminierten Neuroblastomzellen
Weitere Titel
Immunophenotyping of Disseminated Neuroblastoma Cells
VerfasserOberndorfer, Sarah
Erschienen2012
Datum der AbgabeJuli 2012
SpracheEnglisch
DokumenttypBachelorarbeit
Schlagwörter (DE)Neuroblastom / CD56 / CD57 / CD15 / CD44 / Tumor initiierende Zellen(TICs)
Schlagwörter (EN)neuroblastoma / CD56 / CD57 / CD15 / CD44 / tumour initiating cells (TICs)
Zugriffsbeschränkung
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Klassifikation
Zusammenfassung (Deutsch)

Immunophänotypisierung von disseminierten Neuroblastomzellen

Das Neuroblastom (NB) ist der häufigste extrakranielle solide Tumor bei Säuglingen und Kleinkindern. Dieser Tumor zeichnet sich durch eine hohe biologische und klinische Heterogenität aus. Die wichtigsten klinischen Größen beim Neuroblastom sind das Stadium der Erkrankung (International Neuroblastoma Staging System INSS/ International Neuroblastoma Risk Group INRG Classification), das Alter des Patienten bei der Diagnose (Cut-off 18 Monate), dem Ort des Primärtumors (wo befindet sich der Tumor) und die genetischen Eigenschaften (wie MYCN-Amplifikation, Ploidie oder 11q-Deletion).

MYCN ist ein Protein, das in 22-25% der NB Patienten und in den meisten Neuroblastomzellen erhöht ist. Dieses Protein wird mit fortgeschrittenem Stadium der Krankheit und daher schlechter Prognose assoziiert. In der Routine werden die Tumorzellen im Knochenmark mit Hilfe von Immunfluoreszenzfärbung mit GD2 und CD56 erkannt. GD2 ist eines der zuverlässigsten Neuroblastom-Marker und CD56 wird auf der Oberfläche von Neuronen und natürlichen Killer-Zellen (NK) exprimiert.

Bisher gibt es nur wenige Informationen in der Weltliteratur über die Expression von disseminierten Tumorzellen (DTC) in Neuroblastom-Patienten. Diese Studie fokussiert sich auf die Identifikation exprimierender Antigene der DTCs. Um über das Expressionsprofil dieser Antigene auf Neuroblastomzellen zu lernen untersuchten wir zunächst die Expression dieser Antigene auf drei verschiedenen NB-Zelllinien (NB-MAR, LAN-1, SK-N-SH). Alle Experimente wurden an Cytospinpräparate durch Immunfluoreszenzfärbung mit GD2 und folgenden Markern durchgeführt: 1) CD57, welches CD56 ähnlich ist und auf NK Zellen exprimiert wird. 2) CD15, welches in neuralen Stammzellen exprimiert wird und als tumor-initiierender Zellmarker (TIC) gesehen wird. TICs sind Zellen mit stammzellähnlichen Eigenschaften, sie sind in der Lage Tumore zu verursachen, sich selbst zu erneuern und zu differenzieren. 3) CD24 wird in Zellen der neuronalen Differenzierung und Reifung exprimiert. 4) Expression von CD44 wird mit günstiger Prognose assoziiert. Bei CD44 positiven Zellen ist MYCN reduziert, bei CD44 negativen Zellen ist MYCN erhöht und mit einer schlechten Prognose assoziiert. 5) CD34 und CD133 sind als Marker hämatopoetischer Stammzellen bekannt.

Es wurden drei NB-Zelllinien verwendet, NB-MAR und LAN-1, die MYCN amplifiziert und GD2 positiv sind, und SK-N-SH welches MYCN als Einzelkopie besitzt und GD2 nicht exprimiert. 96% der drei Zelllinien exprimieren CD56.

Das Ergebnis zeigte eine schwache CD57 Expression in 50% der SK-N-SH Zellen, während 5% der LAN-1 und 1% der NB-MAR Zellen CD57 und GD2 exprimieren.

Die Expression von CD15 wird durch kleine hochpositive Einzelzellen gekennzeichnet. LAN-1 exprimiert jedoch auch in großen Zellen CD15.

CD44-Expression wird durch große Zellen mit viel Cytoplasma, so genannten F-Zellen welche MYCN reduziert sind, gekennzeichnet.

98% aller NB-Zellen waren CD24-positiv. Weiters wurde keine Expression von CD34 und CD133 in unseren Experimenten beobachtet. Für eine klare müssen weitere Experimente durchgeführt werden.

Nach den bisherigen Experimenten wurden die NB-Zelllinien doppelt gefärbt mit CD15 und CD44. Es wurde angenommen, dass diese beiden Antigene auf verschiedenen Zellen exprimiert werden - CD15, ein TIC-Marker und CD44, ein Marker für seneszente Zellen. 30% der LAN-1 Zellen co-exprimieren CD15 und CD44, was die Einzelfärbung bestätigt. NB-MAR Zellen waren weniger als 1% doppelt positiv und bei SK-N-SH konnte keine Co-Expression von CD15 und CD44 festgestellt werden.

Basierend auf diesem Ergebnis wurde NB Patientenmaterial mit GD2/ CD15 und GD2/ CD44 gefärbt. Das Ergebnis zeigte 20% der GD2 positiven Zellen exprimiert CD15 während keine CD44-positive Zelle nachgewiesen werden konnte.

CD15 und CD44 sind potenzielle Antikörper, um mehr über das biologische Verhalten von DTCs zu erfahren. So könnten diese Antigene ei

Zusammenfassung (Englisch)

Immunophenotyping of disseminated neuroblastoma cells

Neuroblastoma (NB) is the most common extra cranial solid tumour in infants and early childhood. The most important clinical variables in predicting patients outcome are the stage of disease (International Neuroblastoma Staging System INSS/ International Neuroblastoma Risk Group INRG Classification), the age of the patient at the diagnosis (cut-off 18 months), the site of primary tumour (where the tumour is located) and the genetic properties (like MYCN amplification, ploidy or 11q deletion).

MYCN is a protein which is amplified in 22-25% of NB patients’ and in most NB cell lines. This protein is generally associated with advanced stages of disease and poor outcome. In the routine the tumour cells in the bone marrow samples were detected by immunofluorescence staining against GD2 and CD56. GD2 is one of the most reliable NB markers and CD56 is expressed on the surface of neurons and natural killer cells.

Until now only little information is available in the world literature about the expression pattern of disseminated tumour cells (DTCs) in neuroblastoma patients. In this study we focussed on the identification of different antigens expressed on DTCs. In order to learn about the expression profile of these antigens on neuroblastoma cells, we first examined the expression pattern of these antigens on three different NB cell lines (NB-MAR, LAN-1, SK-N-SH). All experiments were performed on cytospin preparations by immunofluorescence method with GD2 co-stained with following markers of interest:

1) CD57 - which is similar to CD56 and expressed on NK cells. 2) CD15 is expressed on neural stem cells and therefore, could serve as a possible tumour initiating cell (TIC) marker. TICs are cells whose properties resemble stem-like cells showing self-renewal and differentiation capacity. 3) CD24 is expressed on cells of neural differentiation and maturation. 4) CD44 expression is related to low stage and favourable prognosis of NB because it is associated with reduced MYCN amplification. Accordingly, CD44 negative NB cells are MYCN amplified and associated with a poor prognosis. 5) CD34 and CD133 are known as haematopoietic stem cell markers.

For following experiments, three NB cell lines were used, NB-MAR and LAN-1 which are MYCN amplified and GD2 positive, and SK-N-SH which has a MYCN single copy and do not express GD2. However, 96% of all cell lines express CD56.

The result demonstrated that a clear weakly CD57 expression was only observed in 50% of SK-N-SH cells whereas only 5% of LAN-1 and 1% of NB-MAR cells co-expressed CD57 and GD2.

CD15 expression is limited to single cells. All NB cell lines show positivity at single small cells. However, in LAN-1 big cells were positive for CD15.

CD44 expression is characterized by large cells with large cytoplasm, so called F-cells, which are reduced at MYCN amplification.

98% of all NB cells were positive for CD24. Further, no expression of CD34 and CD133 was observed in our experiments. For a clear statement further experiments have to be performed.

According to previous experiments NB cell lines were double stained against CD15 and CD44. These two antigens are assumed to be expressed on different cells - CD15, representing a TIC marker and CD44, a marker for senescent cells. Only 1% of the NB-MAR cells were double positive for CD15 and CD44. SK-N-SH showed no co-expression of CD15 and CD44. However, we found that 30% of LAN-1 cells co-express CD15 and CD44. In LAN-1 the double positive cells were mostly of the F-type which is in concordance to our findings with single antibody staining using only CD15.

Based on this result, NB patients’ material was stained against GD2/ CD15 and GD2/ CD44. The result revealed 20% of the GD2 positive cells to co-express CD15 whereas no CD44 positive cell could be detected.

CD15 and CD44 are potential antibodies to shed more light on the biological behaviour of DTCs. Thus, these antigens may