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Title
Einfluss von Apoptose auf die Zusammensetzung des Serumproteoms
Additional Titles
Influence of Apoptosis on the Serum Proteome
AuthorRainprecht, Desirée
Published2012
Date of SubmissionNovember 2012
LanguageGerman
Document typeBachelor Thesis
Keywords (DE)Serumproteom / Komplementsystem / C1q / Zytokine / Apoptose / Oxaliplatin / HCC1143 / 7AAD / Membranbläschen / PBMC / Kokultur / TLR4 / Zytokinassay
Keywords (EN)serum proteome / complement system / C1q / cytokine / apoptosis / oxaliplatin / HCC1143 / 7AAD / Membrane blebs / PBMC / coculture / TLR4 / cytokinassay
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Classification
Abstract (German)

Kurzfassung

In dieser Arbeit sollte festgestellt werden, welchen Einfluss Apoptose auf das Serumproteom hat und welche nachfolgenden immunologischen Reaktionen ausgelöst werden.

Zu Beginn der Arbeit sollte eine Methode zur Induktion der Apoptose bei der Tumorzelllinie HCC1143 erstellt werden, um verschiedenen Stadien der Apoptose darstellen zu können. In der frühen Phase der Apoptose kippt das Phosphatidylserin in der Zellmembran nach außen, Membran und Zellkern sind aber noch intakt. In weiterer Folge (späte Apoptose) verliert die Zelle ihre Membranintegrität, gefolgt von DNA Abbau. Diese Phasen galt es am Durchflusszytometer getrennt mittels Fluoreszenzfärbung in drei Populationen darzustellen. Die Detektion erfolgte mittels 7AAD Färbung. Gesunde und früh apoptotische Zellen sind negativ für 7AAD-Bindung. Der Farbstoff 7AAD bindet an DNA und kann nur durch permeabilisierte Zellmembranen durch, macht also spät apoptotische Zellen sichtbar. Nachdem DNA-Abbau aber voranschreitet, nimmt das 7AAD-Signal ab. Diese Zellen wurden dann nach der Bindung des Komplementfaktors C1q detektiert. Dazu mussten die Zellen mit humanem AB-Serum inkubiert werden. Zur Induktion der Apoptose galt es die richtige Menge des Chemotherapeutikums Oxaliplatin, sowie die Dauer der Behandlung zu ermitteln, um die drei Populationen detektieren zu können. Eine Konzentration von 80µM und eine Behandlungsdauer von 48 Stunden erwiesen sich schließlich als erfolgversprechend.

Um nun den Einfluss von Apoptose auf das Serumproteom, im Speziellen der Zytokine, studieren zu können, galt es die drei detektierten Populationen mittel fluoreszenzaktivierter Zellsortierung zu trennen und mit mononukleären Zellen des peripheren Bluts zu kokultivieren. Aus den Kokulturen wurden dann die Überstände entnommen, um aus diesen nach abgegebenen Zytokinen zu detektieren. Von insgesamt 11 gemessenen Zytokinen wurden TNF-a, IL-1ß, IL-6, IL-10, IL-8 und kleinere Mengen von IL-2 und IL-4 in den Kokultivierungen ausgeschüttet.

Am Ende konnte keine eindeutige Aussage darüber getroffen werden, inwiefern apoptotische Zellen die Zytokinausschüttung bei den Immunzellen induzierten, da nach der Sortierung die Anzahl an Zellen in den jeweiligen Populationen sehr gering war. Dennoch gab das Ergebnis Aufschluss darüber, dass speziell der Toll-Like-Receptor 4 bei der Immunantwort eine große Rolle spielte. Des Weiteren zeigten die Ergebnisse noch zusätzliche Aspekte, die noch mit berücksichtigt werden müssen. Die mit Abstand stärkste Zytokinausschüttung zeigte nämlich die Kokultur mit dem Mediumüberstand der behandelten Zellen.

Das Ergebnis war zufriedenstellend, da die erhaltenen Daten einen sehr guten Ausgangspunkt für weitere Versuche darstellen.

Abstract (English)

The main target in this thesis was to investigate the influence of apoptosis on serum compounds, especially cytokines. First, a method for induction of apoptosis in the tumor cell line HCC1143 had to be established, to show the different phases of apoptosis. In early apoptosis phosphatidylserin in the cell membrane flips to the outside. The membrane and nucleus still keep intact. In late apoptosis the cell loses its membrane integrity, followed by DNA degradation. These phases should be shown via flow fluorescent cytometry in three distinct populations. The detection was performed with 7AAD-staining. Viable and early apoptotic cells are negative for 7AAD binding. The vital dye 7AAD binds to doublestranded DNA and can pass through cells only when the membrane is already permeabilised, thus labeling only late apoptotic cells. Since DNA-degradation progresses, the 7AAD signal loses its intensity. These cells were then analyzed by their binding of complement factor C1q. Therefor the cells had to be incubated with AB serum. A concentration of 80µM and 48 hours of treatment were the proper parameters for induction of apoptosis with the chemotherapeutic Oxaliplatin.

The next step was to separate the three detected populations via fluorescent activated cell sorting and to cocultivate them with peripheral blood mononuclear cells. After 24 hours of cocultivation the supernatants were collected and a cytokinassay was performed. From a total of 11 cytokines TNF-a, IL-1ß, IL-6, IL-10, IL-8 and small amounts of IL-2 and IL-4 were secreted after co-cultivation.

At the end it was not possible to show how the apoptotic cells influenced the cytokine-secretion, because after cell sorting the amount of cells of the three populations was too less. Nevertheless, the results showed that maybe specifically Toll-Like-Receptor 4 was targeted due to immune response. Additionally the cytokinassay revealed that the coculture with the supernatant of the medium of the treated cells showed the strongest cytokin induction.

Finally, the results were satisfying anyhow, because the received data can be used as basis for ongoing experiments.

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