Titelaufnahme

Titel
Die Rolle von RhoQ im Vermitteln der Effekte des Notch-Signalwegs während der Angiogenese
Weitere Titel
Role of RhoQ in Mediating the Effects of Notch-Signalling during Angiogenesis
VerfasserRamberger, Evelyn
Erschienen2012
Datum der AbgabeJuli 2012
SpracheEnglisch
DokumenttypBachelorarbeit
Schlagwörter (DE)Angiogenese ist essentiell für Tumor Wachstum / Vielversprechendes Thearpie target / VEGF spielt zentrale Rolle in Angiogenese / Resistenz gegen anti-VEGF Therapie / neues target nötig / Dll4/Notch Signalweg / Negativer Regulator der Angiogenese / RhoQ wird durch Dll4/Notch induziert / Rolle von RhoQ während Angiogenese? / Ausschalten/Überexpression von RhoQ in HUVEC / Untersuchen: Proliferation / Migration / Netzwerkbildung / Sprossung / Adhäsion / Induktion von / Dll4/Notch / RhoQ ist wichtig für normale Funktion von HUVEC / zu wenig oder zu viel RHhoQ negative Auswirkung auf Proliferation / Migration / Ausschalten von RhoQ reduziert Adhäsions Fähigkeiten / RhoQ interagiert möglicherweise mit Integrinen / Integrin beta1 ist auf der Zelloberfläche von RhoQ knockdown HUVEC verringert / Knockdown führt zu übermaßiger Sprossung / Überexpression zu verminderter Sprossung / --> RhoQ ist möglicherweise in tip cell Selektion involviert / Notch signalling wird auf dem transkriptionellen Level nicht von RhoQ beeinflus
Schlagwörter (EN)angiogenesis hallmark of tumour growth / promising target / VEGF central role / VEGF therapy resistance / new target / Dll4/Notch signalling / negative regulator of angiogenesis / RhoQ a target of Dll4/notch signalling / role of RhoQ in angiogenesis? / knockdown (HUVEC shRhoQ)/overexpression of RhoQ in HUVEC / study tube formation / proliferation / migration / sprouting / adhesion / Notch signalling induction / RhoQ is important for HUVEC functionality / imbalance effects proliferation / migration negatively / knockdown reduces adhesion abilities / RhoQ might interact with integrins / integrin beta1 is reduced on surface of HUVEC shRhoQ / knockdown leads to hypersprouting / overexpression leads to reduced sprouting / -->RhoQ might be involved in tip cell selection / Notch signalling induction is not affected on transcriptional level by / knockdown/overexpression / RhoQ might be a suitable therapy target / in vivo experiments neccessary
Zugriffsbeschränkung
 _
Klassifikation
Zusammenfassung (Deutsch)

Blutgefäßsystem nicht nur die Versorgung mit Nährstoffen und Sauerstoff gewährleistet,

sondern auch Wege der Metastasierung bereitstellt. Blockade von Tumor Angiogenese ist

daher ein vielversprechender Therapieansatz, wobei die meisten verfügbaren Therapeutika

auf den vascular endothelial growth factor (VEGF) oder seinen Rezeptor (VEGR) zielen. Der

VEGF Signalweg ist von zentraler Bedeutung in Angiogenese, jedoch führen anti-VEGF

Therapien häufig zu Resistenz, während einige Tumoren von Anfang an nicht auf die

Behandlung ansprechen. Ein alternatives Therapie-target stellt der Dll4/Notch Signalweg dar,

der von zentraler Bedeutung in Zelldifferenzierungen ist und als negativer Regulator der

Angiogenese fungiert. Für eine effiziente und spezifische Therapie Strategie ist es essentiell,

die downstream Antworten, die nach Induktion des Signalwegs erfolgen, zu verstehen und die

Gene zu identifizieren, die an der Vermittlung der Effekte von Dll4/Notch signalling beteiligt

sind.

Die kleine GTPase RhoQ, auch TC10 genannt, wurde in einem gene array als Dll4/ NOTCH

signalling target in menschlichen Endothelzellen der Nabelschnurvene (HUVEC) identifiziert.

RhoQ pendelt zwischen einem inaktiven GDP gebundenen und einem aktiven GTP

gebundenen Zustand. Es ist bekannt, dass Rho GTPasen die Bildung von Filopodien in

verschiedenen Zelltypen induzieren und an der Reorganisation des Aktin Zytoskeletts, Zell-

Matrix Kontakten und Zell Mobilität beteiligt sind. Darüber hinaus wurde herausgefunden, dass

RhoQ in der Delokalisierung von GLUT4 eine Rolle spielt. Dieses Projekt zielt darauf ab

herauszufinden, welche Rolle RhoQ in der Vermittlung der Effekte von Dll4/Notch signalling

während der Angiogenese spielt.

RhoQ wurde in HUVEC dauerhaft überexprimiert (HUVEC RhoQ) oder dauerhaft

ausgeschaltet (HUVEC shRhoQ). Verschiedene Zell basierte Assays wurden sowohl mit

HUVEC RhoQ als auch mit HUVEC shRhoQ durchgeführt, um den Einfluss von RhoQ auf

Netzwerk Bildung, Zell Mobilität, Zell Adhäsion und Sprossung zu bestimmen. Zusätzlich

wurden die Zellen mit immobilisiertem Dll4/ BSA als Kontrolle stimuliert um zu beobachten, ob

RhoQ die Induktion von Notch signalling beeinflusst.

Die Resultate lassen darauf schließen, dass die richtige Menge an RhoQ für die Zelle von

großer Bedeutung ist, da sowohl Überexpression als auch Knockdown von RhoQ

Zellproliferation und Zell Migration stark negativ beeinflussen. Es wurde ebenfalls beobachtet,

dass Überexpression und Knockdown von RhoQ Netzwerkbildung in ein einem Matrigel

Assay inhibiert. Live Cell Imaging enthüllte, dass die schlechten Matrigel Assay Resultate von

HUVEC shRhoQ möglicherweise auf verminderte Adhäsionsfähigkeiten zurück zu führen

sind. Diese Annahme wurde durch ein Adhäsion Assay bestätigt. Die veränderten

Adhäsionseigenschaften könnten das Resultat verminderter Integrin Funktionalität oder

veränderter Integrin Lokalisation sein. Integrin beta1 ist von besonderem Interesse, da in der

Literatur eine Rolle in Angiogenese und eine Interaktion mit den Dll4/Notch Signalweg

beschrieben werden. FACS Analysen zeigten, das Integrin beta1 an der Zelloberfläche von

HUVEC shRhoQ weniger vorhanden ist als in der Kontrolle. Dieser Effekt wird nach

Stimulation mit Dll4 Ligand noch deutlicher. Es ist möglich, dass RhoQ an der

Delokalisierung von Integrin beta1 beteiligt ist, diese Annahme muss jedoch noch durch

Immunofluoreszenz-Färbung bestätigt werden. Es ist ebenfalls von Interesse, die

Funktionalität und Lokalisierung von anderen Integrin-Untereinheiten in HUVEC

shRhoQ/HUVEC RhoQ zu studieren.

Unsere Experimente haben gezeigt, dass RhoQ nicht auf dem transkriptionellen Level mit

Dll4/Notch signalling interagiert. Die Resultate des hanging drop Assays, ein Assay um

Sprossung in vitro zu studieren, implizieren, dass RhoQ an der Dll4/Notch vermittelten tip cell

Selektion beteiligt ist. Ko-Lokalisierung von RhoQ un

Zusammenfassung (Englisch)

Role of RhoQ in mediating the effects of Notch signalling during angiogenesis

Angiogenesis, vessel sprouting from pre-existing ones, plays a crucial role in tumour growth

as it not only provides the tumour with oxygen and nutrients but also facilitates metastasis.

Blocking angiogenesis therefore has become a promising strategy of cancer treatment.

Several signalling pathways are involved during angiogenesis; however the vascular

endothelial growth factor (VEGF) seems to play a central role and is well described in

literature. Initial and acquired resistance to therapies blocking VEGF or its receptor still

remains a problem which stresses the need for alternative targets. One such target could be

the delta like 4 (DLL4)/Notch signalling pathway, which is known to play an essential role in

several cell fate decisions and which serves as a negative regulator during angiogenesis by

regulating the number of tip cells. Understanding the downstream responses and identification

of genes involved in mediating the effects of Dll4/Notch signalling is essential for developing

an effective and specific treatment strategy.

The small GTPase RhoQ also known as TC10 was identified as a Dll4 target in human

umbilical vein endothelial cells (HUVEC). RhoQ is a small GTPase that cycles between an

inactive GDP bound and an active GTP bound state. Rho GTPases are known to induce the

formation of filopodia in various cell types and they are involved in reorganization of the actin

cytoskeleton, cell motility and cell adhesion. It has been published that RhoQ is important for

the trafficking of GLUT4 and other molecules, suggesting that RhoQ is involved in membrane

fusion. This project aims to investigate the role of RhoQ in mediating the effects of Notch

signalling during angiogenesis.

RhoQ was permanently overexpressed (HUVEC RhoQ) and knocked down (HUVEC

shRhoQ) in HUVEC to investigate the role of RhoQ in mediating the effects of Dll4/Notch

signalling during angiogenesis. Several cellular based assays were carried out with HUVEC

RhoQ and HUVEC shRhoQ to study RhoQs impact on proliferation, tube formation,

migration, sprouting and adhesion. Additionally, we stimulated the cells with immobilized Dll4/

BSA as a control to assess if RhoQ effects induction of Notch signalling.

The findings reveal that RhoQ balance is crucial for normal cellular functions of HUVEC

since proliferation and migration are negatively affected by overexpression and knockdown

of RhoQ. It was also oberserved that overexpression and knockdown of RhoQ inhibit tube

formation in a matrigel assay. Live cell imaging revealed, that the poor assay outcome of

HUVEC shRhoQ might be due to decreased adhesion abilities, which was confirmed by an

adhesion assay. The modified adhesion abilities could be a result of altered integrin

functionality or localisation. Integrin beta1 is of particular interest because it is described to be

involved in during angiogenesis and to interact with the Notch/Dll4 signalling pathway. FACS

analysis revealed that Integrin beta1 surface localization is decreased in HUVEC shRhoQ, an

effect that becomes even more obvious upon stimulation with Dll4. It is possible that RhoQ

might be responsible for trafficking integrin beta1 to the surface. Immunofluorescence

staining and co-localisation of RhoQ and integrin beta1 in HUVEC /HUVEC shRhoQ/ HUVEC

RhoQ would be required to prove this assumption. It would also be of interest to look at other

integrins as RhoQ might interact not only with integrin ?1 but also other subunits.

Our experiments showed that RHOQ does not interfere with Dll4/Notch signalling on a

transcriptional level and that HUVEC shRhoQ and HUVEC overexpressing RhoQ are still

able to induce Notch signalling. The results from the hanging drop assay, an assay to study

endothelial cell sprouting in vitro, suggests that RhoQ is involved in Dll4/mediated tip cell

selection