Titelaufnahme

Titel
Evaluierung des allergenen Potenzials von Fischarten mit zunehmender wirtschaftlicher Bedeutung
Weitere Titel
Evaluation of Allergenic Potential of Fish Species with Increasing Economical Importance
VerfasserSteinbauer, Andrea
Erschienen2012
Datum der AbgabeJuli 2012
SpracheDeutsch
DokumenttypBachelorarbeit
Schlagwörter (DE)Nahrungsmittelallergie / Fischallergene / Parvalbumin / IgE-Immunblot / Massenspektrometrie
Schlagwörter (EN)food allergy / fish allergens / parvalbumin / IgE-immunoblot / mass spectrometry
Zugriffsbeschränkung
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Klassifikation
Zusammenfassung (Deutsch)

Das Projekt „Evaluierung des allergenen Potenzials von Fischarten mit zunehmender wirtschaftlicher Bedeutung“ hatte zum Ziel, potenzielle Allergene einerseits der welsartigen Fisch-Spezies

Europäischer Wels, Afrikanischer Wels, Tigerwels, Pangasius und des Hybrides Claresse®

und andererseits des Kugelfischverwandten Drückerfisch zu identifizieren.

Fisch kann eine IgE-vermittelte Nahrungsmittelallergie induzieren. Das Hauptallergen

Parvalbumin, ein hitzestabiles Protein mit einem Molekulargewicht von 12 kDa, ist in den

meisten Fällen verantwortlich für eine allergische Immunreaktion. Die Immunantwort erfolgt in

einem Zeitraum von Sekunden bis wenigen Stunden, und Symptome reichen von der

Beeinträchtigung der Atemwege und Verdauung über Hautausschläge bis zu

anaphylaktischen Schock-Reaktionen. Da in den letzten Jahren Fisch auch in Binnenländern

als Nahrungsmittel an Beliebtheit zunahm und durch die Globalisierung die Vielfalt an

Speisefischarten stetig stieg, ist es wichtig diese „neuen“ Spezies hinsichtlich ihrer Allergenität

zu untersuchen.

Dazu wurden zuerst wässrige Extrakte hergestellt einerseits von erhaltenen

gefriergetrockneten weißen Fischmuskeln der oben erwähnten Spezies und andererseits von

als Dialysate bezeichneten Proben, in denen hitzestabile Proteine und darunter vermutlich

auch Parvalbumine angereichert waren. Zusätzlich wurden aus den Fischmuskelextrakten

durch Zentrifugieren des in PBS unlöslichen Materials auch Pellets gewonnen, die zur

Analyse direkt im denaturierenden 4x Probenpuffer aufgenommen wurden. Nach der

Proteinkonzentrationsbestimmung der Fischextrakte nach Bradford wurde eine SDS-PAGE

durchgeführt und das Gel mit Coomassie gefärbt, um einen Überblick über die vorhandenen

Proteine zu erhalten. Bereits hier war festzustellen, dass die Fischarten mit hoher

Wahrscheinlichkeit das Protein Parvalbumin besitzen. Desweiteren war zu erkennen, dass

der Drückerfisch über eine geringere Konzentration an Parvalbumin als die welsartigen

Fische verfügte. Dieser Unterschied ließ sich in allen weiteren Testverfahren beobachten. Die

nachfolgenden Immunblots und Inhibitionsblots mit spezifischen Anti-Parvalbumin Antikörper

bestätigten, dass die Fischspezies Parvalbumin enthielten. Für den Nachweis, ob

Parvalbumin und auch andere im Fischmuskel enthaltene Proteine der untersuchten Spezies

allergenes Potenzial besitzen, wurden IgE-Immunblots und Inhibitionsblots mit Seren von

Fischallergikern durchgeführt. Hier konnten nun durch die eindeutig erkennbare IgE-

Reaktivität gegen in den Extrakten vorhandene Parvalbumine, diese als Allergene verifiziert

werden. Zusätzlich zeigten auch andere Proteine eine IgE-Reaktivität, welche zum Teil recht

patientenspezifisch waren. Einige dieser unbekannten Allergene wurden

massenspektrometrisch analysiert, um Informationen über deren Identität zu erhalten. Im

Falle des Drückerfisches konnten so einige Kandidatenproteine identifiziert werden. Die

Notwendigkeit in Zukunft zur genaueren Analyse der unbekannten potentiellen Allergene noch

andere Testverfahren (z.B.: zweidimensionale Immunblots) einzusetzen, um eindeutigere

Daten erhalten zu können, wurde diskutiert.

Zusammenfassung (Englisch)

The idea of the project ”Evaluation of allergenic potential of fish species with increasing economical

importance” was to identify potential allergens on one hand of the catfish-like

(order Siluriformes) fish species European catfish, African catfish, tiger catfish, iridescent

shark and the hybrid Claresse® and on the other hand of the unicorn leatherjacket (order

Tetraodontiformes).

Fish can induce an IgE-mediated food allergy. The major allergen parvalbumin, a heat-

stable protein with a molecular weight of 12 kDa, is in most cases responsible for an

allergic immune response. The immune response occurs in the period from seconds to a

few hours. The symptoms can affect the respiratory and digestive system and could lead

to skin problems, such as urticaria and sometimes to an anaphylactic shock.

It is important to investigate these "new" species regarding their potential allergenicity,

because the popularity of fish as food and the variety of fish species have also increased

steadily in land-locked countries by globalization in recent years.

First of all extracts were prepared from lyophilized white fish muscle of the above

mentioned species and from samples, called dialysates, which were enriched in heat-

stable proteins, and among them most likely also in parvalbumin. In addition, pellets were

obtained from the fish muscle extracts by centrifugation of insoluble material. For analysis

these pellets were directly dissolved in 4x denaturing sample buffer. After protein

concentration determination by Bradford a SDS-PAGE was performed and the gel was

stained with Coomassie to get an overview of the existing proteins in these fish extracts.

Already here it was possible to determine that these fish species possess the protein

parvalbumin with high probability. Moreover the unicorn leatherjacket showed a lower

concentration of parvalbumin than the catfish-like species. The presence of a lower

amount of parvalbumin in unicorn leatherjacket was corroborated in all further tests. The

subsequent immunoblots and inhibition blots with a specific anti-parvalbumin antibody

confirmed that the fish species contained parvalbumin. In order to prove whether

parvalbumin and other proteins contained in the fish muscle of the studied species have

allergenic potential, IgE-immunoblots and inhibition blots with sera from fish allergic

patients were performed. These experiments provided evidence that parvalbumins

represent allergenic molecules in these species because of the clearly recognizable

presence of IgE-reactivity. Interestingly, also other proteins displayed IgE-reactivity, some

of these potential allergens were recognized only by a few patients. To obtain information

about the identity of these novel potential allergens, some of these unknown allergens were

selected and analyzed by mass spectrometry. And in case of unicorn leatherjacket a few

potential allergens could be identified. The necessity to apply in future for a more specific

analysis of the unknown potential allergens also other techniques (e.g., two-dimensional

immunoblots) is discussed.