Titelaufnahme

Titel
Die Rolle von Yen1, Uls1 und Histon H3 Azetylierungen in der DNS Doppelstrangbruchreparatur
Weitere Titel
The role of Yen1, Uls1 and histone H3 acetylations in DNA double-strand break repair
VerfasserBauer, Stefanie
Erschienen2012
Datum der AbgabeSeptember 2012
SpracheEnglisch
DokumenttypBachelorarbeit
Schlagwörter (DE)DNS Reparatur / Holliday Junction / Homologe Recombination / Nicht-homologe Endvereinigung / Histon Azetylierungen
Schlagwörter (EN)DNA repair / Holliday Junction / Homologous Recombination / Non-homologous End Joining / Histone Acetylations
Zugriffsbeschränkung
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Klassifikation
Zusammenfassung (Deutsch)

Die Rolle von Yen1, Uls1 und Histon H3 Azetylierungen in der DNS Doppelstrangbruchreparatur

Yen1 und sein menschliches Homolog Gen1 sind Nukleasen, die zur Rad2/XPG Klasse gehören. Es wurde bewiesen, dass Yen1/Gen1 Holliday Junctions auflösen kann. Diese Strukturen sind Intermediärstrukturen, die während des Prozesses der homologen Rekombination durch das Einwandern des Einzelstranges des homologen Chromosoms entstehen, der als Vorlage für die Doppelstrangbruchreparatur dient. Eine Holliday Junction kann über mehrere Wege aufgelöst werden, von denen der Yen1-Pathway noch nicht vollständig charakterisiert wurde. Bei C. elegans Gen-1 wurde gezeigt, dass es auch eine Funktion in der zellulären Antwort auf DNS-Schäden hat. Zusätzlich wurde bewiesen, dass Yen1 auf molekularer Ebene mit SUMO und in Folge mit Uls1 interagiert. SUMO ist der kleine Ubiquitin-artige Modifizierer, der viele Aufgaben in zellulären Prozessen innehat, wohingegen Uls1 verdächtigt wird, SUMO-modifizierte Proteine für den Abbau über das Ubiquitin-Proteasom System zu markieren. Im ersten Teil dieser Arbeit werden die Verbindungen zwischen Yen1, SUMO und Uls1 erforscht. Ein Yeast two-hybrid Assay wurde mit einem Yen1 Allel durchgeführt, bei dem alle Lysinreste in den letzten 250 Aminosäuren durch Arginin ersetzt wurden. Des Weiteren wurden Yen1-Fragmente in verschiedenen Längen untersucht. Es wurde gezeigt, dass die letzten 200 Aminosäuren im Yen1 Protein für die molekulare Interaktion mit SUMO und Uls1 nötig sind, jedoch erlaubte das Experiment keine weiteren verlässlichen Schlüsse.

Eine Western blot Analyse mehrerer Proteine, die nachgewiesenerweise in vivo SUMO-modifiziert sind, zeigte, dass hohe Konzentrationen des DNS-schädigenden Stoffes Methylmethansulfonat die meisten davon destabilisiert. Zusätzlich scheint Yen1 in der Abwesenheit von Uls1 stabilisiert zu sein.

Wird Uls1 aus einem diploiden Stamm mit mus81 Knock-Out entfernt, scheint das einen vergleichbaren Effekt zu erzeugen wie die Entfernung von Yen1 aus selbigem Stamm, obwohl die Sporulationseffizienz im angewandten Arthintergrund unter dem detektierbaren Niveau für diese zwei Stämme war.

Sowohl Western blot Analyse der Effektorkinase der DNS Schadensantwort, Rad53, als auch RT-qPCR Analyse deren Effektorgene, der Ribonukleotidreduktase Gene, zeigten dass im Gegensatz zum C. elegans Homolog Gen-1, K. lactis Yen1 keinerlei Role im Mec1-abhängigen Pfad der DNS Schadensantwort in der Hefe innehat.

Im zweiten Teil dieser Arbeit wird die Rolle der N-terminalen Azetylierungen des Histons H3 erforscht. Histone sind streng konservierte Proteine, aus denen das Chromatin besteht und die essentiell für die Aufbewahrung der DNS in den Zellen sind. Histone werden verdächtigt, auch epigenetische Rollen in vielen zellulären Prozessen, unter anderem der DNS Reparatur, zu haben. Es wurde in der Gruppe gezeigt, dass eine Mutation, die Azetylierungen im H3 N-Terminus verhindert, zu Zellen mit defekter DNS Reparatur führt, weshalb untersucht wurde, ob diese Mutation die Expression von an der DNS Reparatur beteiligten Genen beeinflusst. RT-qPCR Analyse zeigte, dass unerwarteterweise die Expression mehrerer Gene erhöht war, was auf eine konstante zelluläre Antwort auf ständige Schäden an der DNS hindeutet.

Eine Southern blot Analyse verschiedener H3 Mutationen sollte dann zeigen, ob die untersuchten Mutationen zu Änderungen im Beitrag von HR- und NHEJ-Pfaden zur Reparatur eines künstlich erzeugten Doppelstrangbruches führten. Aufgrund kontaminierter Proben sollte das Experiment wiederholt werden, konnte jedoch nicht im Rahmen des Praktikums nicht beendet werden.

Zusammenfassung (Englisch)

The role of Yen1, Uls1 and Histone H3 acetylations in DNA double-strand break repair

Yen1 and its human homolog Gen1 are nucleases belonging to the Rad2/XPG class. Yen1/Gen1 has been proven to cleave Holliday Junctions. These structures are intermediates that develop during the process of homologous recombination as a consequence of strand invasion of the homologous chromosome in order to serve as template for double-strand break repair. A Holliday Junction can be resolved by several pathways, of which the Yen1-pathway is not yet fully characterized. C. elegans Gen-1 has also been shown to have a function in the DNA damage response. Additionally, it has been proven that Yen1 interacts molecularly with SUMO, and by extension with Uls1. SUMO is the Small Ubiquitin-like Modifier that has various tasks in cellular processes, whereas Uls1 has been suspected of being able to target SUMO-modified proteins for degradation by the ubiquitin-proteasome system. In the first part of this thesis, the relationship between Yen1, SUMO and Uls1 was investigated. A yeast two-hybrid assay was performed with a yen1-allele with all lysine residues in the last 250 amino acids replaced for arginine. Additionally, several truncated forms of Yen1 in different lengths were examined.

It was shown that the last 200 amino acids in Yen1 were necessary for the molecular interaction between Yen1, SUMO and Uls1, but otherwise this assay allowed no reliable conclusions.

A Western blot analysis of several proteins that were proven to be SUMOylated in vivo showed that high concentrations of the DNA damaging agent methyl methansulfonate destabilize most of them. Additionally, Yen1 seems to be stabilized in the absence of Uls1.

Removing Uls1 from a diploid strain where mus81 had been deleted seems to have a comparable effect on meiosis as the removal of Yen1 from a mus81 negative diploid strain, though the sporulation efficiency in the used strain background was below detection levels for those mutations.

Both Western blot analysis of the DNA damage response effector kinase Rad53 and RT-qPCR analysis of expression levels of ribonucleotide reductase genes, the effector genes of the DNA damage response, showed that, unlike C. elegans Gen-1, K. lactis Yen1 does not have a role in the Mec1-dependent pathway of DNA damage response in yeast.

In the second part of this thesis, the role of N-terminal acetylations of the Histone H3 were investigated. Histones are strongly conserved proteins that make up the chromatin and that are essential for the storage of DNA in the cells. Histones have been suspected to have epigenetic roles in various cellular processes, among them DNA repair. Since it had been shown in the laboratory before that a mutation preventing acetylation in the H3 N-terminus leads to cells defective in DNA-repair, it was investigated whether this mutation affects the expression of DNA repair genes. RT-qPCR analysis showed that, unexpectedly, expression levels were elevated in several cases, which indicates constant cellular responses to persistent DNA damage.

A Southern blot analysis of several different H3 mutations should then show whether the examined mutations lead to changes in the contribution of HR and NHEJ pathways to the repair of an artificially induced double-strand break. Due to contaminated samples, the experiment was set up to be repeated but could not be finished during the internship.