Titelaufnahme

Titel
Validierung einer Bestimmungsmethode für ausgewählte Opioide und deren : Stoffwechselprodukte in Haaren mittels HPLC-MS-MS
Weitere Titel
Validation of a method for determination of selected opioids and their Metabolites in hair by HPLC-MS-MS
AutorInnenPisarz, David
Erschienen2013
Datum der AbgabeJuli 2013
SpracheDeutsch
DokumenttypBachelorarbeit
Schlagwörter (DE)Methodenvalidierung / Opioide / Fahreignungsdiagnostik / Abstinenznachweis
Schlagwörter (EN)Method validation / Opioids / driving ability diagnostics / abstinence proof
Zugriffsbeschränkung
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Klassifikation
Zusammenfassung (Deutsch)

Tramadol ist ein vollsynthetisch hergestelltes Arzneimittel aus der Gruppe der schwach

wirksamen Opioide und wird zur Behandlung mittelstarker bis starker Schmerzen

eingesetzt. Obwohl Tramadol ein geringes Abhängigkeitspotential zugeschrieben wird und

es neben Meptazinol das einzige injizierbare Opioid-Analgetikum ist, das in der

Bundesrepublik Deutschland nicht unter das Betäubungsmittelgesetz fällt, wird es häufig

als Rauschmittel missbraucht.

Das Ziel dieser Bachelorarbeit war es, aufbauend auf einer bestehenden Methode zur

Bestimmung ausgewählter Opioide und deren Stoffwechselprodukte in Haaren am LCMS-

MS, weitere Substanzen in diese Methode einzuarbeiten und anschließend eine

Validierung aller Substanzen durchzuführen. Die Methode findet Anwendung für

toxikologische Fragestellungen, beispielsweise für Abstinenzkontrollen für die

Fahreignungsdiagnostik im Rahmen einer Medizinisch-Psychologischen Untersuchung

(MPU) und als Beigebrauchskontrolle bei Drogenabhängigen im Substitutionsprogramm.

Die Methodenvalidierung ist ein unabdingbarer Teil der Qualitätssicherung, welcher im

Rahmen der Akkreditierung eines Analyselabors von den Behörden gefordert wird. Nach

erfolgreicher Durchführung ist die Übernahme der Methode in die Routine möglich. Bei

der Validierung wurden folgende Parameter untersucht:

• Testen der Messreihen auf einem Signifikanzniveau von 95%, sowie

Signifikanzniveau von 99% auf Ausreißer

• Varianzhomogenität

• Linearität

• Matrixeffekte/Wiederfindung

• Nachweis-und Bestimmungsgrenze

• Genauigkeit

• Stabilität

Zu Beginn der Arbeit wurde eine intensive Literaturrecherche hinsichtlich der

Geräteeigenschaften, sowie der Probenaufarbeitung und den zu etablierenden

Substanzen Tramadol und Nortramadol betrieben. Mit Hilfe der Laborleitung wurde

anschließend eine Probenaufarbeitungsmethode entwickelt und ein Kalibrationsschema

erstellt. Für die Etablierung der Substanzen in die Methode ist vorab eine

Fragmentionenanalyse notwendig, bei der charakteristische Ionen mit Hilfe von

Geräteeinstellungen für eine Substanz ermittelt werden.

Unter Verwendung der optimierten Aufbereitungsmethode und der für die Substanzen

spezifisch ermittelnden Parameter für das Messverfahren, wurde im Rahmen der

Methodenvalidierung für jede Substanz die Nachweis- und Bestimmungsgrenze nach den

Richtlinien der GTFCh mit Valistat ermittelt.

Die Ergebnisse der Methodenvalidierung lassen folgende Schlüsse zu:

• Bei allen eingegebenen Messreihen ist die Homogenität der Varianzen gegeben,

was die Grundvoraussetzung für die Anwendung eines einfachen linearen

Regressionsmodells ist.

• Bei allen Substanzen ist die Linearität beim Vorläuferionen (Target) vorhanden, so

dass ein lineares Regressionsmodell angewendet werden kann.

• Die Nachweis- und Bestimmungsgrenzen wurden nach der DIN 32645 ermittelt.

Die so errechneten Werte der Nachweisgrenzen der Substanzen liegen zwischen

0,01und 0,05 ng/mg und die der Bestimmungsgrenzen zwischen 0,01und 0,72

ng/mg.

• Die Ergebnisse der Wiederfindungsrate geben an, wie groß der Verlust des

Analyten durch die Methode ist. Unter Einbeziehung des internen Standards liegen

die Werte für die Wiederfindung zwischen (95.3 und 127.5)%. Die Wiederfindung

sollte nach den GTFCh-Richtlinien mindestens 50% betragen.

• Die Untersuchung auf die Stabilität der Substanzen erfolgte über einen Zeitraum

von 35 Stunden. Alle Substanzen wurden als stabil bewertet.

Zusammenfassung (Englisch)

Tramadol is a fully synthetic drug from the group of weak effective opioids and is used to

treat moderate to severe pain. Although tramadol is attributed with a low dependence

potential and is the only injectable opioid analgesic besides meptazinol, which does not

fall within the Federal Republic of Germany under the Narcotics Act, it is often misused as

intoxicants.

The aim of this thesis was to build on an existing method for the determination of selected

opioids and their metabolites in hair on an LC-MS-MS from Agilent and Waters to

incorporate further substances in this method and then perform a validation of all

substances. The method is used for toxicological problems, such as abstinence controls

for the driving ability diagnostics in a medical-psychological assessment (MPA) and drug

abusers in substitution program.

Method validation is an essential part of quality assurance, which is required under the

accreditation of a laboratory analysis of the authorities. After successful completion of the

acquisition of the method it is possible to adopt this new method in the routine. The

following parameters were studied for the validation:

• Test the series on a significance level of 95% and significance level of 99% to

outlier

• Homogeneity of variance

• Linearity

• Matrix effects/Recovery

• Detection and quantification limits

• Accuracy

• Stability

At the beginning of the work an intensive literature research in terms of device properties,

as well as the sample preparation and the substances to be established tramadol and its

metabolite nortramadol was operated. Using the optimized processing method for the

substances and the specific parameters for the measurement method, the detection and

quantification limits according to the guidelines of the GTFCh were determined with

Valistat, a software for method validation in forensic toxicology.

Using the optimized processing method for the substances and the specific parameters

for investigating the measurement method, the detection and quantification limits

according to the guidelines of the GTFCh for each substance were determined with

Valistat.

The results of the method validation allow the following conclusions:

• For all measurements the homogeneity of variances is given, which is a

prerequisite for the application of a simple linear regression model.

• Linearity for all the substances according to the precursor ions (Target) is

guaranteed so that a linear regression model can be used.

• The detection and quantification limits were determined according to DIN 32645.

The calculated values of the detection limits of the compounds are between 0.01

and 0.05 ng/mg and the quantification limits between 0.01 and 0.72 ng/mg.

• The results of the recovery rate indicate how much the loss of the analyte is by

using the method. Including the internal standard, the values for the recovery are

(95.3 to 127.5)%.

• The investigation of the stability of the substances was performed over a period of

35 hours. All substances were rated as stable.

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