Titelaufnahme

Titel
HLA-G Bestimmungsmethoden : Sanger Sequenzierung im Vergleich zu zwei Next Generation Sequencing Plattformen
Weitere Titel
Determination Methods of HLA-G Sanger Sequencing compared to two Next Generation Sequencing Platfomrs
VerfasserNguyen, Anita Thu Huong
Erschienen2014
Datum der AbgabeJuni 2014
SpracheDeutsch
DokumenttypBachelorarbeit
Schlagwörter (DE)MHC Klasse Ib / HLA-G / Sanger Sequenzierung / Next Generation Sequencing / Ion Torrent™ PGM / Illumina MiSeq
Schlagwörter (EN)MCH class Ib / HLA-G / Sanger sequencing / Next Generation Sequencing / Ion Torrent™ PGM / Illumina MiSeq
Zugriffsbeschränkung
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Klassifikation
Zusammenfassung (Deutsch)

Diese Arbeit beschäftigt sich mit dem Humanen Leukozyten Antigen-G (HLA-G) Genort und dessen molekularbiologischer Diagnostik.

HLA-G wird zu den nicht-klassischen MHC Klasse I Molekülen gezählt. Es unterscheidet sich strukturell von den klassischen MHC Klasse I in seinem verkürzten, zytoplasmatischen Ende und funktionell in seinem geringen Polymorphismus. Physiologisch werden HLA-G Moleküle auf Trophoblasten der Plazenta exprimiert, wo sie eine Schutzfunktion für die fetalen Zellen gegen das Immunsystem der Mutter ausführen. Weiters werden diesen Molekülen eine Rolle bei Transplantationen, Autoimmunerkrankungen, Entzündungskrankheiten und Neoplasien zu geschrieben. Durch Interaktionen von HLA-G mit inhibitorischen Rezeptoren zum Beispiel KIR2DL4 können Zellen der NK-vermittelten Lyse entkommen und werden somit geschützt.

HLA-G-Gene werden mittels molekularbiologischen Sequenzierungsmethoden bestimmt. Der derzeitige Goldstandard ist die Sanger Sequenzierung. In den letzten Jahren wurden alternative Methoden entwickelt, die Next Genreration Sequencing Methoden.

Die Sanger Sequenzierung basiert auf einer Kettenabbruch-Methode. Bei dieser Methode werden radioaktiv- oder fluoreszenzmarkierte ddNTPs verwendet. Es erfolgt eine elektrophoretische Auftrennung. Die Auswertung erfolgt entweder mittels Röntgenfilm, der auf dem Gel belichtet und entwickelt wird oder mittels Anregung durch einen Laser und Detektion mit einer CCD Kamera.

Next Generation Sequencing (NGS) ist eine alternative Methode zur Sanger Sequenzierung. Es gibt drei verschiedene NGS-Plattformen, Roche 454 oder Roche junior, Illumina MiSeq™ und Ion Torrent™ PGM. Diese Arbeit geht auf zwei Plattformen, Ion Torrent und Illumina, näher ein. Diese zwei Plattformen beruhen auf dem Prinzip „Sequencing by Synthesis“.

Die Ion Torrent Sequenzierung erfolgt durch pH-Wert Änderungen, die bei Einbau von dNTPs hervorgerufen werden, da ein Proton (H+-Ion) bei diesem Einbau abgespalten wird. Pro Flow wird nur ein definiertes dNTP zugegeben, daher weiß man welche Base eingebaut wurde und kann die erhaltene Sequenz ablesen. Durch Fragmentierung und Adapter-Markierung durch eine Emulsions-PCR (emPCR) entstehen größendefinierte Fragmente, die identifiziert werden können. Diese Reaktionen finden auf einem Semikonduktor Chips statt.

Die Illumina Sequenzierung findet auf Flusszellen statt, die acht unabhängige Kanäle aufweisen. Bei dieser Methode erfolgt die Amplifikation durch eine „Bridge-Amplification“, bei der die DNA-Fragmente an der Flusszelle immobilisiert werden. Die Detektion erfolgt über fluoreszenzmarkierte dNTPs, die gleichzeitig als Terminatoren für die Polymerase fungieren. Nach Abbau der Schutzhülle und des Farbstoffes kann das nächste dNTP angebaut werden. Daher erfolgt immer nur ein Anbau von einem dNTP pro Flow.

NGS Methoden weisen durch ihre massive parallele, klonale Sequenzierung einen Vorteil gegenüber der Sanger Sequenzierung auf, trotz ihrer aufwendigen Probenvorbereitung. Ein weiterer Vorteil ist die Erhöhung des Probendurchsatzes durch die parallele Sequenzierung.

Zusammenfassung (Englisch)

This thesis deals with the human leukocyte antigen-G (HLA-G) loci and its molecular biological diagnosis.

The HLA-G belongs to the non-classical MHC class I molecules. It’s different to the classical MHC class I due to its truncated, cytoplasmic tail and it shows a low polymorphism. These molecules have been found on trophoblast cells of the placenta, where they guard the fetal cells from the maternal immune system. Furthermore these molecules become important to transplantation, autoimmune diseases, inflammatory diseases and neoplasia. By interaction between HLA-G and inhibitory receptors like KIR2DL4 the cells are able to escape from the natural killer cell-mediated lysis and therefore they are protected.

The HLA-G genes will diagnose by molecular biological sequencing methods. The current gold standard is the Sanger sequencing. In the last few years some alternative methods have been developed, the Next Generation Sequencing (NGS).

The Sanger sequencing is based on a chain termination method. This method uses ddNTPs, which are radioactively or fluorescently labelled. Afterwards a electrophoretic separation follows. The analysis is carry out by developing an X-ray film or by stimulation with laser light and detection with a CCD camera.

The Next Generation Sequencing (NGS) is an alternative method to the Sanger sequencing. There are three different NGS platforms, the Roche 454 or the Roche junior, the Illumina MiSeq and the Ion Torrent™ PGM. This thesis deals with two of these methods, the Ion Torrent™ PGM and the Illumina MiSeq. Both are based on the principle of “Sequencing by Synthesis”.

The Ion Torrent sequencing results from a pH value change, which is induced by incorporation of dNTPs, because a proton will be split off. Per flow one defined dNTP is added, so it is known which base is incorporated and the new sequence can be read. By fragmentation and adaptor labelling via an emulsion PCR size-defined fragments are generated, which can be identify. These reactions take place on semiconductor chips.

The Illumina sequencing takes place on flow cells, which contain eight independent canals. In this method the amplication of DNA fragments is conducted by bridge amplication, on which the fragments are immobilised. The detection results from fluorescent labelled dNTPs. The fluorescent dye acts as terminator for the polymerase. After depletion of their protective cover and of the dye the next dNTP can be incorporate. Per flow only one dNTP can be incorporated.

The NGS methods feature due to their massively parallel, clonal sequencing a benefit compared to the Sanger sequencing, in spite of their complex sample preparation. Another advantage is the increase of the throughput of samples by the parallel sequencing.