Titelaufnahme

Titel
Entwicklung von High Troughtput ELISA für inflammatorische Zytokine von Wiederkäuern.
Weitere Titel
Development of high throughput ELISA for ruminant inflammatory cytokines.
VerfasserBenold, Raphael
Erschienen2014
Datum der AbgabeJuli 2014
SpracheEnglisch
DokumenttypBachelorarbeit
Schlagwörter (DE)Zytokine / ELISA / IL-6 / IL-1beta / INF-gamma / TNF-alpha / 384 Well-Platten
Schlagwörter (EN)Cytokines / ELISA / IL-6 / IL-1beta / INF-gamma / TNF-alpha / 384 well-plates
Zugriffsbeschränkung
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Klassifikation
Zusammenfassung (Deutsch)

Um zu verstehen wie Wiederkäuer auf Hitzestress reagieren, ist es notwendig, den

Zytokingehalt vor, während und nach der Hitzebehandlung zu beobachten. Um die

Zytokinkonzentration im hightroughput Verfahren zu messen, wurden ELISAs im 384

Format gewählt. Die richtigen Konfigurationen für jeden Zytokintest wurden mit 96 Well

Format ELISAs gefunden, weil sie uns mehr Flexibilität erlaubten und leichter durchzuführen

waren. Die Auswertung der Hase anti-Zytokinpeptid Antikörper zeigte ein hohes

Hintergrundsignalproblem und Versuche das Signal zu reduzieren waren nicht erfolgreich.

Wir fokussierten uns auf zugekaufte Antikörper um die Zytokin ELISAs zu entwickeln. Wir

nutzten das Streptavidin-Biotin-System um das Signal zu verstärken und die Sensitivität zu

erhöhen. Als das Substrat mit der besten Sensitivität bei niedrigen Zytokinkonzetrationen

wurde TMB befunden. Während wir die Reagenzien getestet haben, haben wir die richtigen

Bedingungen für das genaue und reproduzierbare Transferieren von Reagenzien und

Lösungen in die Wells der 384 Well Platten mit einem Liquid-Handling System ermittelt.

Nachdem wir die optimalen Reagenzien und das richtige Setup für das automatische

Pipettiersystem gefunden haben, konnten wir erfolgreich IL-1β, TNF-α und INF-γ mit einer

Nachweisgrenze von mindestens 31.25 pg Zytokin/ml in Serum im 384 Well-Format messen.

Zusammenfassung (Englisch)

To understand how the ruminant responds to heat stress it is necessary to observe the

cytokine levels before, during and after the heat treatment. ELISAs in a 384 well format are

the method of choice to measure the cytokine concentration in serum in a high throughput

manner. To find the right configuration for each cytokine assay we used 96 well format

ELISAs as they allow more flexibility and are easier to execute. Evaluation of the rabbit anticytokine

peptide antibodies showed a high background problem and attempts to reduce this

were unsuccessful. We turned to commercial reagents to develop the cytokine ELISAs. The

streptavidin-biotin system was incorporated to amplify the signal and enhance sensitivity.

TMB substrate was found to offer the best sensitivity at lower cytokine concentrations. While

evaluating the reagents, we established the optimal conditions to ensure accurate and

reproducible delivery of the reagents and diluents to the wells of the 384 well plates by a

liquid handling robot. Having optimised selection of the commercial reagents and their use,

and the liquid handling parameters, we succeeded in setting up 384 well format sandwich

ELISAs to measure IL-1β, TNF-α and INF-γ with a LOD of least 31.25 pg cytokine/ml in

serum.