Titelaufnahme

Titel
Zellbasierte Testsysteme für den Antioxidant Response Pathway
Weitere Titel
Cell based test systems for the antioxidant response pathway
VerfasserGlück, Nicole
GutachterCzerny, Thomas
Erschienen2014
Datum der AbgabeJuli 2014
SpracheEnglisch
DokumenttypBachelorarbeit
Schlagwörter (DE)Nrf2 / antioxidant response element / allergische Kontaktdermatitis / Hautsensibilisierung / dual luciferase Assay
Schlagwörter (EN)Nrf2 / antixodant response element / allergic contact dermatitis / dual luciferase assay / skin sensitization
Zugriffsbeschränkung
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Klassifikation
Zusammenfassung (Deutsch)

Allergische Kontaktdermatitis (ACD) ist die Manifestation einer allergischen Reaktion ausgelöst durch Haut-Sensibilisierung, die wiederum durch kleine, Protein-reaktive chemische Substanzen hervorgerufen wird. ACD entwickelte sich mittlerweile zur meist verbreitetsten Form allergischer Reaktionen. Zur Zeit wird die Bestimmung des Haut-Sensibilisierungs-Potenzials von Substanzen mit Hilfe des murinen, lokalen Lymphknoten Assays (LLNA) durchgeführt, da hierfür noch keine validierten, nicht-tierischen Testmethoden existieren. Aus diesem Grund wurde in dieser Arbeit an der Weiterentwicklung eines Zellkultur-basierten Testsystems, das den Nrf2-antioxidant response Signalweg zur Bestimmung von Haut-Sensibilisatoren nutzt, gearbeitet. Die Reporter-Konstrukte zur Analyse der Signalweg-Aktivität mittels Luciferase-Assay wurden dahingehend optimiert, dass sie mit verschiedenen Luciferasen als Reportergene getestet und um mRNA- und Protein-destabilisierenden Signale sowie unterschiedliche, multimerisierte ARE-Sequenzen upstream eines minimal Promotors erweitert wurden. Des Weiteren wurde ein zweite, konstitutiv exprimierte Luciferase als interne Referenz eingeführt. Die optimierten Reporter-Konstrukte wurden durch Screenen von 8 Substanzen, deren Haut-Sensibilisierungs-Potenzial bereits bekannt ist, in transienten Experimenten getestet und anschließend in HaCat, MCF-7 and HeLa Zellen stabil integriert. Die Ergebnisse der transienten Experimente zeigten, dass der Einsatz der sensitiveren Nano luciferase als Reportergen zur Erhöhung der Sensitivität des Assays beiträgt. Bislang konnten mit einer optimierten, stabilen HaCat Zelllinie vergleichbare Ergebnisse zum KeratinoSens Assay erzielt werden. Stabile Linien mit integriertem Nano luciferase Reporter befinden sich hingegen noch in der Austestungsphase.

Zusammenfassung (Englisch)

Allergic contact dermatitis (ACD) is the manifestation of an allergic response caused by the skin sensitization of small protein-reactive chemical substances (reviewed in Kimber et al. 2002) and has turned to be the most prevalent form of allergic responses. Currently, prediction of the skin sensitization potential of substances is performed with the murine local lymph node assay (LLNA) as there are no validated non-animal assays existing to date. Thus, in this work a cell culture test system focusing on the Nrf2-antioxidant response pathway for prediction of skin sensitizers was further developed. The reporter constructs for analysing pathway activity via luciferase assay was optimized by testing different luciferases with mRNA and protein destabilizing signals as reporter genes and multimerizing different antioxidant response element (ARE)-sequences upstream of the minimal promotor. Furthermore, a second, constitutive luciferase was introduced to provide an internal reference. Testing the optimized reporter construct by screening through 8 reference substances of known skin sensitization potential in transient experiments using MCF-7 cells was followed by stably integrating the optimized reporter construct in HaCat, MCF-7 and HeLa cells. Transient experiments showed that the use of the more sensitive Nano luciferase is a promising tool to increase assay sensitivity. For the stable cell lines so far an optimized HaCat line showed comparable results to the KeratinoSens system. Stable cell lines using the optimized Nano luciferase reporters are still on their way to be further characterized.