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Title
Zellkultur Testsysteme für extrazelluläre Matrixbestandteile, isoliert aus humaner Plazenta
Additional Titles
Cell culture testing systems for extracellular matrix components, isolated from human placenta
AuthorHinterndorfer, Matthias
Published2014
Date of SubmissionJuly 2014
LanguageGerman
Document typeBachelor Thesis
Keywords (DE)Kollagen / Extrazelluläre Matrix / Placenta / Salzfällung / Hepatozyten / Zellkultur / Tissue Engineering
Keywords (EN)Collagen / Extracellular matrix / Placenta / Salt precipitation / Hepatocytes / Cell culture / Tissue engineering
Restriction-Information
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Classification
Abstract (German)

Ziel dieser Arbeit war die Isolation von verschiedenen Kollagentypen aus dem Basalgewebe humaner Placenta durch limitierten Pepsinverdau und selektive Salzfällung. Das etablierte Protokoll resultierte in einer durchschnittlichen Ausbeute von 557 mg Kollagenen pro 100 g Nassgewicht eingesetzten nativen Basalgewebes. Die isolierten Matrixproteine wurden Bestimmung des DNA Gehalts und durch Western Blot charakterisiert. Dabei konnten ein hoher Reinheitsgrad und eine Reduktion zellulärer Bestandteile um über 99 % nachgewiesen werden. Die für den physiologischen Einsatz wichtige Salzkonzentration wurde mithilfe von Leitfähigkeitsmessungen ermittelt.

Zur Testung der Biokompatibilität der Kollagene wurden primäre Rattenhepatozyten isoliert. Durch eine Collagenase-Perfusion der Leber konnten bis zu 1,2 x 108 Hepatozyten gewonnen werden. Zellkulturgefäße wurden mit den isolierten Kollagenen der Fraktionen I+III beschichtet und die Leberzellen darauf kultiviert. DAPI Färbung und CK-18 Immunmarkierung zeigten eine hohe Spezifität der Hepatozyten. MTT Tests bewiesen eine signifikante Steigerung der Zellviabilität auf kollagenbeschichteten Oberflächen, im Vergleich zu Gelatinebeschichtungen und nicht beschichteten Platten 24 Stunden nach der Aussaat. Die Leberzellen wurden bis zu 7 Tage in Kultur gehalten. Weitere Anwendungen für die isolierten humanen Kollagene, wie die Produktion von Hydrogelen oder 3D-Scaffolds wurden getestet.

Abstract (English)

In this study different fractions of collagen types were isolated from human placenta basal tissue by limited pepsin digestion and selective salt precipitation, resulting in average yields of 557 mg collagens per 100 g tissue wet weight. The purified extracellular matrix proteins were characterized by evaluation of DNA content and by Western blots, which proved high purity and a reduction of cellular components of over 99 %. Salt concentration was determined by measurement of conductivity.

For testing of biocompatibility of collagens, rat liver hepatocytes were isolated by whole organ collagenase perfusion via the portal vein, resulting in a yield of up to 1.2 x 108 cells. Dishes were coated with isolated collagens I+III and used for the cultivation of hepatocytes. DAPI and CK-18 immunostaining proved hepatocyte specificity of cultivated cells. MTT tests showed a significant increase of cell viability on collagen coated plates 24 h after cell seeding compared to gelatine coated and uncoated plates. Hepatocytes were kept in culture for up to 7 days. Further applications, like production of hydrogels or 3D-scaffolds were tested.

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