Titelaufnahme

Titel
Optimierung rekombinanter Plasmid-Vektoren für die Proteinexpression in Escherichia coli
Weitere Titel
Optimising recombinant plasmid vectors for protein expression in Escherichia coli
VerfasserKreismayr, Julia
Erschienen2014
Datum der AbgabeJuli 2014
SpracheDeutsch
DokumenttypBachelorarbeit
Schlagwörter (DE)pET E.coli T7-Expressionssystem / Superoxid-Dismutase (SOD) / Escherichia coli (E.coli) / pET30a (+)-Vektor / Gibson Assembly
Schlagwörter (EN)pET E.coli T7-expression system / superoxide dismutase (SOD) / Escherichia coli (E.coli) / pET30a (+) vector / Gibson Assembly
Zugriffsbeschränkung
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Klassifikation
Zusammenfassung (Deutsch)

Die Position und Orientierung verschiedener Schlüsselelemente auf einem

Expressionsvektor beeinflusst das Wachstum des Wirtsorganismus und die Ausbeute der rekombinanten Proteinproduktion.

Im Zuge dieser Arbeit wurde die Auswirkung der Anordnung der 4 Elemente

Plasmid-Replikationsursprung, Kanamycin-Resistenz-Gen, lacI-Repressor-Gen und dem Produktgen Superoxid-Dismutase (SOD)-Gen auf den pET30a (+)-Vektor im

pET Escherichia coli (E.coli) T7-Expressionssystem evaluiert. Um die Einflüsse im Detail untersuchen zu können, wurden 30 unterschiedliche Varianten des Vektors mit Hilfe der synthetischen Klonierungsmethode Gibson Assembly hergestellt und in chemisch kompetente E.coli transformiert.

Die Plasmid-DNA wurde mittels Minipräparation isoliert und mit Hilfe molekularbiologischer, zellbiologischer und analytischer Arbeitsmethoden analysiert.

Es konnten 3 Varianten des Vektors evaluiert werden, die das Protein Superoxid-Dismutase im Expressionsversuch produzierten. Die Varianten stellten dabei im Vergleich mit dem Ursprungsvektor pET30a (+) weniger Protein in Form von Inclusion Bodies dar.

Die Ergebnisse lassen vermuten, dass diese 3 Varianten des Plasmids das Protein eher in löslicher Form herstellen, als der Ursprungsvektor. Diese Theorie kann durch weitere Expressionsversuche in größerem Maßstab ausführlich untersucht werden.

Zusammenfassung (Englisch)

Position and orientation of key elements on vectors for gene expression are influencing the growth of the host cells, hence the product yield.

In this bachelor thesis the composition of the 4 elements origin of replication, kanamycin-resistance-gene, lacl-repressor-gene and the product gene superoxide-dismutase-gene on the pET30a (+)-vector in the pET Escherichia coli T7-expression system was evaluated. By using the Gibson Assembly, which allows for the joining of multiple DNA fragments in a single, isothermal reaction, 30 different compositions of the vectors were arranged and transferred into competent E.coli cells subsequently to find and analyse possible influences. Plasmid DNA was extracted and purified by a miniprep based on the alkaline lysis and analysed with several analytical methods afterwards. 3 different variations of the vector expressing the superoxid dismutase protein could be found. All these variants showed less protein in inclusion bodies when compared to the original pET30a (+) vector. The results are leading to the conclusion that the modified vectors generate a soluble form instead of inclusion bodies. To support this theory, further large scale experiments shall be conducted.