Titelaufnahme

Titel
Analyse von natürlichem und rekombinantem Pru p 3, dem Hauptallergen des Pfirsichs
Weitere Titel
Analysis of natural and recombinant Pru p 3, the major peach allergen
VerfasserLanger, Cornelia
GutachterRaith, Marianne
Erschienen2014
Datum der AbgabeJuli 2014
SpracheEnglisch
DokumenttypBachelorarbeit
Schlagwörter (DE)Lipidtransfer Protein / Pru p 3 / Immunbologie / Allergie / Pfirsich / 2D-Gelelektrophorese
Schlagwörter (EN)lipid transfer protein / Pru p 3 / Immunology / allergy / peach / 2D-gel-electrophoresis
Zugriffsbeschränkung
 _
Klassifikation
Zusammenfassung (Deutsch)

Diese Arbeit beschäftigt sich mit dem Lipid-Transfer Protein Pru p 3, dem Hauptallergen im Pfirsich (Prunus persica). Zu diesem Zweck wurden Pfirsichextrakte hergestellt sowie ein rekombinantes Pru p 3 expremiert und aufgereinigt, um sie mit biochemischen und immunologischen Methoden, wie zum Beispiel einer 2D-Gelelektrophorese, Immunoblots und Silberfärbung, zu charakterisieren. Um das rekombinante Pru p 3 in der in vitro Diagnostik einsetzen zu können, ist es wichtig, es mit der natürlichen Form zu vergleichen. Die Allergenizität des rekombinanten Pru p 3 wurde in ELISA und Immunoblots mit verschiedenen Patientenseren getestet. Während im ELISA nur LTP-allergische Patienten starke IgE Reaktivität gegenüber Pru p 3 zeigten, reagierten beinahe alle Patienten im Immunoblot mit dem rekombinanten Pru p 3. Aus diesem Grund wurde darauf geschlossen, dass entweder die Faltung des rekombinanten Pru p 3 von der natürlichen Form abweicht, oder, dass Patienten mit dem Histidin-tag des Proteins reagieren. Da man mit Silberfärbung eine höhere Sensitivität als mit Coomassie erreicht, wurde zusätzlich diese Methode genutzt, wobei Probleme bei der Färbung des basischen Proteins Pru p 3 auftraten. Zumindest konnte für das ebenfalls basische Protein Avidin diese Methode etabliert werden und man darauf schließen, dass nicht der basische Charakter von Pru p 3 der Grund für das Misslingen der Färbung war. Ein weiterer Grund könnte die geringe Konzentration von Pru p 3 in den Extrakten sein, da eine Detektion durchaus möglich war mit spezifischen Antikörpern gegen LTP in Immunoblots, einer noch sensitiveren Methode. Aufgrund der biochemischen Charakteristika von Pru p 3, dem hohen isoelektrischen Punkt von ~9.5 und dem relativ kleinen Molekulargewicht von 12-15 kDa, wurden eine isoelektrische Fokussierung und eine 2D-Gelelektrophorese durchgeführt, die es erlauben Pru p 3 von den ~17 kDa großen Bet v 1 verwandten Proteinen zu unterscheiden. Das ist vor allem deshalb wichtig, da diese Proteine ebenfalls in Pflanzen auftreten und vor allem in Zentraleuropa eine differenzielle Diagnose stattfinden muss, um Bet v 1-, Birkenpollenallergien, mit unangenehmen aber nicht lebensbedrohlichen Symptomen, von LTP-Allergien zu unterscheiden, die akute Reaktionen wie Anaphylaxie auslösen können. Generell kann die Verwendung von rekombinanten Pru p 3 in der Allergie Diagnostik von Vorteil sein, wobei noch weitere Experimente durchgeführt werden müssen, um herauszufinden, ob es sich wie sein natürliches Gegenstück verhält. Weiters müssen Methoden etabliert werden um entweder die Konzentration von Pru p 3 oder die Sensitivität der Detektions-Methoden zu erhöhen.

Zusammenfassung (Englisch)

This study focuses on the analysis of the lipid transfer protein Pru p 3, a major allergen from peach (Prunus persica). Therefore extracts were prepared and recombinant Pru p 3 was expressed and purified followed by characterization using differentbiochemical and immunological methods such as 2D-gel-electrophoresis, immunoblots and silverstaining. To use the recombinant Pru p 3 in in vitro diagnosis, it is important to compare it to its natural form. The allergenicity of the recombinant Pru p 3 was tested in ELISA and immunoblots using different patients’ sera. In ELISA, LTP-allergic patients showed a strong IgE reactivity to Pru p 3, whereas in the immunoblot nearly every patient reacted to the recombinant Pru p 3. Therefore it was assumed that either the folding of the recombinant protein was different than of the natural counterpart or patients reacted with the histidine tag of the recombinantly produced protein in the immunoblot. As Coomassie staining has a low sensitivity, silverstaining was performed. Unfortunately, silverstaining of the basic protein Pru p 3 was not successful, although several conditions were tested. However, finally a silverstaining method for the basic protein avidin could be established, indicating that other issues than its alkalinecharacteristic are accountable for the failure of the staining. One possible explanation could be the relatively low concentration of Pru p 3, in the extract, because using specific antibodies to LTP in immunoblotting allowed its detection. In addition,isoelectric focusing and furthermore 2D-gel-electrophoresis were performed as Pru p 3 has two major biochemical characteristics, an unusual high isoelectric point of approximately 9.5 and a small molecular weight of about 12 to 15 kilodalton (kDa). A combination of those two features allows the discrimination of Pru p 3 and the ~17 kDa small Bet v 1-related proteins also occuring in plant material. Especially in Central Europe a differential diagnosis of a sensitization to LTP and the more common sensitization to Bet v 1, the major birch pollen allergen, is crucial because LTP can cause severe reactions such as anaphylaxia, whereas sensitization to Bet v 1 is nasty, but not life-threatening. In general, the use of recombinant Pru p 3 might have some benefits in allergy diagnostics however further experiments have to be done to determine if it behaves like its natural counterpart. Furthermore methods have to be established to either increase the concentration of natural Pru p 3 or to increase the sensitivity of detection methods.