Titelaufnahme

Titel
Charakterisierung der Interaktion zwischen Allergenen und respiratorischen Epithelzellen
Weitere Titel
Characterization of the Interaction between Allergens and Airway Epithelial Cells
VerfasserMühlberger, Jacqueline
GutachterRaith, Marianne
Erschienen2014
Datum der AbgabeJuli 2014
SpracheEnglisch
DokumenttypBachelorarbeit
Schlagwörter (DE)Bet v 1 - IgE ELISA - Western Blot - Immunfluoreszenzfärbung - Antikörperevaluierung - Fixierung von Zellen
Schlagwörter (EN)Bet v 1 - IgE ELISA - Western Blot - immunofluorescence staining - evaluation of antibodies - fixation of cells
Zugriffsbeschränkung
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Klassifikation
Zusammenfassung (Deutsch)

Hauptziel dieser Bachelorabeit war die Charkterisierung der Interaktion zwischen Allerge-nen und Epithelzellen des respiratorischen Traktes, insbesondere des Birkenpollen-hauptallergens Bet v 1, welches für eine Vielzahl von im Frühjahr auftretenden Pollenallergien in Europa und Nordamerika verantwortlich ist.

Um die Rolle von Bet v 1 an der epithelialen Zellschicht zu untersuchen, wurden ver-schiedene Varianten des rekombinanten Bet v 1 miteinander verglichen und evaluiert. So auch eine eigens hergestellte rekombinante His-tag Variante von Bet v 1, welche mit anderen bereits im Labor verfügbaren Varianten verglichen wurde. Um die IgE-Bindungs-kapazität dieser rekombinanten Bet v 1 Varianten zu testen, wurde ein IgE- ELISA mit verschiedenen Patientenseren durchgeführt. Um festzustellen inwieweit die Struktur solcher rekombinanten Formen mit jener des in der Natur vorkommenden Bet v 1 übereinstimmen, wurden CD (Circulardichroismus) Messungen durchgeführt.

Um herauszufinden, ob Allergene einen Einfluss auf die Integrität der epithelialen Barriere haben, wurden primäre nasale Epithelzellen (pNEC) sowie eine immortalisierte bronchiale Epithelzelllinie (BEAS 2B) mit rekombinantem Bet v 1, mit Birkenpollenextrakt (BPE) oder mit Interferon-gamma (IFNγ), oder stimuliert. Die Integrität der epithelialen Barriere wurde durch die Messung des transepithelialen Widerstandes (TEER) untersucht. Zusätzlich wurden Immunfluoreszenz¬färbungen und Western Blots mit Antikörpern, welche gleich-zeitig Marker für verschiedene Komponenten des Zytoskeletts darstellen, durch¬geführt. Um die optimalen Bedingungen für Fluoreszenzfärbungen und Western Blot zu erlangen, war es wichtig sowohl eine optimale Fixiermethode also auch eine passende Antikörper-verdün¬nung zu finden. Als optimalste Fixiermethode erwies sich eine Mischung, welche zu gleichen Teilen aus Methanol und Aceton bestand, wohingegen beim Western Blot ein Puffer mit β-Mercaptoethanol als reduzierendes Agens sich sehr gut für die Lyse von epithelialen Zellen eignete. Antikörper gegen acetyliertes Tubulin, E-Cadherin, Occludin und Vimentin zeigten positive Signale sowohl in Immunfluoreszenzfärbungen als auch im Western Blot, während Färbungen mit Antikörpern gegen Zonula occludens nur schwache Signale gab und eine Färbung für MUC5AC mit beiden Detektionsmethoden sich gar als völlig negativ erwies.

Im Rahmen der Bachelorarbeit ist es gelungen, optimale Bedingungen für Immunblots und Immunlokalisationen der Epithelzellen zu etablieren. Erste Ergebnisse unter diesen optimierten Bedingungen zeigten keine signifikanten Unterschiede zwischen unbehandel-ten und mit IFNγ, BPE oder Bet v 1stimulierten Epithelzellen. Auch TEER–Messungen zeigten keine Unterschiede in der Integrität der epithelialen Barriere. Weitere Tests sind nötig, um den Einfluss von Allergenen auf das Epithel besser evaluieren zu können.

Zusammenfassung (Englisch)

The major aim of this bachelor thesis was the characterization of the interaction between allergens and epithelial cells of the upper respiratory tract, especially the reaction to the major birch pollen allergen, Bet v 1, which is the main cause for tree pollen-mediated allergies in early spring with a high prevalence in Northern and Central Europe.

To investigate the role of Bet v 1 on the epithelial cell layer, different recombinant variants of Bet v 1 were used, among them, a His-tagged variant of Bet v 1, which was produced during this Bachelor thesis. This His-tagged variant was compared to other recombinant forms which were already available in the laboratory: To compare their IgE binding capacity, an IgE ELISA using different patients’ sera was performed, in addition, the secondary structures were determined by measuring circular dichronism spectra.

To determine, whether allergens have an influence on the integrity of the epithelial barrier, primary nasal epithelial cells (pNEC) and an immortalized bronchial epithelial cell line (BEAS 2B) were stimulated with the recombinant Bet v 1 variants, with birch pollen extract (BPE), and with interferon-gamma (IFNγ). Transepithelial resistance (TEER) was measured as well as immuno¬fluores¬cence stainings and Western blots were performed using antibodies to different cytoskeletal components or extracellular matrix proteins. To test the ideal conditions for the immuno¬fluores¬cence stainings and the Western blot, different methods of fixation or lysis and different dilutions of the antibodies were tested. Fixation of cells for immunolabeling showed the best results when using a mixture of methanol and acetone, whereas cell lysis for Western blotting showed the best signals when using ß-mercaptoethanol as a reducing agent. Antibodies to acetylated tubulin, E-cadherin, occludin, and vimentin showed positive signals in both, immunofluorescence stainings and Western blotting, whereas stainings with antibodies to zonula occludens (ZO-1) only gave weak signals and staining for MUC5AC was completely negative in both methods.

During the thesis, ideal conditions for immunoreactions were established. First application of these methods showed no differences in the epithelial barrier function after stimulation with IFNγ, BPE, or Bet v 1. Also TEER measurements did not show any differences in the integrity of epithelial barrier. Further tests need to be done in order to evaluate the interaction of the allergens with the epithelium.