Titelaufnahme

Titel
Entwicklung eines 96plex Assays zur : Hochdurchsatzanalyse von DNA Methylierung in klinischen Tumorproben mittels Mikrofluidik-qPCR
Weitere Titel
Development of a 96-plex assay for high-throughput analysis of DNA methylation of clinical samples via microfluidic qPCR
AutorInnenSchwaiger, Carmen
Erschienen2014
Datum der AbgabeJuli 2014
SpracheDeutsch
DokumenttypBachelorarbeit
Schlagwörter (DE)Epigenetik / DNA-Methylierung / Entwicklung eines 96-plex -Assays
Schlagwörter (EN)Epigenetics / DNA-methylation / Development of a 96-plex assay
Zugriffsbeschränkung
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Klassifikation
Zusammenfassung (Deutsch)

Die DNA Methylierung als Biomarker zur frühzeitigen Erkennung von Tumoren hat sich in den letzten Jahren immer stärker durchgesetzt und ist in den Fokus vieler Forschungsprojekte gerückt. Die stabile Bindung der Methylgruppe an die 5’-Position des Cytosins und die einfache Möglichkeit der Detektion machen die DNA Methylierung zum idealen Kandidaten für diagnostische Anwendungen in klinischen Labors.

Ziel der vorliegenden Arbeit, war die Entwicklung eines 96-plex Assays für ein mikrofluidisches Hochdurchsatz-qPCR System (HTqPCR) zur Detektion von DNA-Methylierung mittels methylierungssensitiven Restriktionsenzymen (MSRE) in klinischen Tumorproben. Die HTqPCR erlaubt die simultane Detektion von bis zu 96 Assays x 96 Proben (9216 PCRs) in einem Lauf, wodurch eine Effizienzsteigerung durch Ersparnis von Zeit und Reagenzien erreicht wird.

Mittels Hochdurchsatz-Design-Software wurden für 120 tumorassoziierte Sequenzen Assays designt und vorab in in silico Analysen getestet. Es wurden 152 Assays designt und für die Entwicklung des 96-plex Assays herangezogen. Die Qualität der Assays wurde mittels der Performance Parameter PCR-Effizienz, Linearität und theoretische 1ng Detektion sowohl im Singleplex-Ansatz, als auch im Multiplex-Ansatz erhoben. Die 90 Assays mit der besten Performance wurden für die Entwicklung des 96-plex Assays verwendet.In weiteren Analysen wurden für diese Assays die Nachweisgrenze (Limit of Detection = LOD) und die Quantifikationsgrenze (Limit of Quantification = LOQ) ermittelt. Validiert wurde der Assay mittels Spike-Reihen mit Standards an bekannter Menge methylierter DNA. Als Positivkontrollen dienen 6 Assays, je 2 davon zielen auf methylierte bzw. unmethylierte Genregionen und 2 Assays wurden ohne Schnittstellen für die MSREs designt.

Conclusio: Der 96-plex Assay für HTqPCR-Anwendungen wurde erfolgreich entwickelt und mittels Spike-Reihen validiert. LOQ und LOD liegen für >90% der Assays im einstelligen Kopienbereich.

Zusammenfassung (Englisch)

DNA methylation as a biomarker for early detection of tumours has established in the last few years and moved into focus of many research projects. The stable binding of the methyl-group to the 5’-position of cytosine and an easy detection makes DNA methylation to the ideal candidate for diagnostic applications in clinical laboratories.

The aim of this thesis was the development of a 96-plex assay for a micro fluidic high-throughput-qPCR system (HTqPCR) for detection of DNA-methylation via methylation-sensitive restriction enzymes (MSRE) in clinical tumour samples. With HTqPCR a simultaneously detection of 96 assays x 96 samples (9216 PCRs) is possible within one run, leading to an increase of efficiency via saving time and reagents.

With the use of a high-throughput design software assays for 120 tumour-associated sequences have been designed and tested in in silico analyses. 152 assays have been designed and used for the development of the 96-plex assay. The assay quality has been tested via the performance parameter “PCR-efficiency”, “linearity” and “theoretical 1ng detection” in singleplex-approaches as well as multiplex-approaches. 90 assays with the best performance were used for the development of the 96-plex assay. In further analyses the Limit of Detection (LOD) and the Limit of Quantification (LOQ) have been determined for these assays. Validation was done using spike-sets with standards of a known quantity of methylated DNA. For positive controls 6 assays were used. Two of them targeted methylated or unmethylated gene regions and two assays were designed without recognition sites for MSREs.

Conclusion: The 96-plex assay for HTqPCR-applications was successfully developed and validated via spike-sets. LOQ and LOD are in single copies for over 90% of the assays.

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