Titelaufnahme

Titel
Klonierung, Expression und Reinigung von rekombinanten Kalzium-bindenden Allergenen (Phl p 7, Sal s 1 and Clu h 1)
Weitere Titel
Cloning, expression and purification of recombinant calcium-binding allergens (Phl p 7, Sal s 1 and Clu h 1)
AutorInnenWoroszylo, Konrad
GutachterWank, Herbert
Erschienen2014
Datum der AbgabeJuli 2014
SpracheEnglisch
DokumenttypBachelorarbeit
Schlagwörter (DE)Klonierung / Expression / Reinigung / Phl p 7 / Sal s 1 / Clu h 1 / rPhl p 7 Mut. / rSal s 1 Mut. / rClu h 1 Mut. / Allergien / Kalzium / Kalzium-bindende Allergene
Schlagwörter (EN)Cloning / Espression / Purification / Phl p 7 / Sal s 1 / Clu h 1 / rPhl p 7 Mut. / rSal s 1 Mut. / rClu h 1 Mut. / Allergies / Calcium / Calcium-binding allergens
Zugriffsbeschränkung
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Klassifikation
Zusammenfassung (Deutsch)

Allergien sind Überempfindlichkeitsstörungen, an denen mehr als 25% der Weltbevölkerung leidet. Sie sind Immunerkrankungen, auf die der Organismus mit der Produktion von Immunglobulin E gegen harmlose Antigene reagiert. Die Analyse der cDNA der Allergene zeigte, dass Kalzium-Bindungsstellen in vielen Allergenen vorhanden sind. Prozesse die durch Kalzium-bindende Proteine beeinflusst werden sind zB Muskel-kontraktion, Signaltransduktion, Nukleotid-Stoffwechsel und Zellzykluskontrolle. Phl p 7, ist ein Kalzium-bindendes Protein und Minor-Graspollenallergen welches wir erfolgreich als mutierte Version klonierten, indem wir die Ca2+-Bindungsstellen zerstörten. Dieses rekombinante, mutierte Protein wurde in E. coli überexprimiert und gereinigt. Das Hauptallergen in Fischen, Parvalbumin, ist in weißer, schnell kontrahierender Muskulatur niederer Wirbeltiere lokalisiert, wobei nur Frösche und Fische Allergien verursachen. Auch mutierte Parvalbumine mit funktionslosen Ca2+-Bindungsstellen wurden in E. coli überexprimiert. Diese Mutanten neigten zur Dimerisierung bzw.Oligomerisierung, was durch Zugabe einer zusätzlichen Menge β Mercaptoethanol für rClu h 1 Mut., aber nicht für rSal s 1 Mut., behoben werden konnte. Wir waren dennoch in der Lage, beide Parvalbumin Mutanten über Western Blot nachzuweisen. Weiteres optimieren der Expressionsbedingungen der drei Allergene und testen der IgE-Reaktivität mit Patientenseren, könnte von großer Bedeutung für zukünftige Immuntherapien sein.

Zusammenfassung (Englisch)

Allergies are hypersensitivity disorders from which more than 25% of the world’s population suffer. They are immune disorders to which the organism reacts by producing immunoglobulin E against harmless antigens. Analysis of cDNA encoding allergens showed that calcium-binding sites are present in many allergens. Processes, influenced by calcium-binding proteins are for example muscle contraction, signal transduction, nucleotide metabolism or cell cycle control. Phl p 7, a calcium-binding protein and a minor grass pollen allergen was successfully cloned as a mutant version by destroying the Ca2+-binding sites. This recombinant mutant protein was overexpressed in E. coli and purified. The major fish allergen, parvalbumin, is localized in white, fast contracting muscles of lower vertebrates, but only from frogs and fishes it causes allergies. Ca2+-binding-deficient parvalbumin mutants were also overexpressed in E. coli. These mutants tended to dimerize or oligomerize, which could be resolved by using increasing amounts of β-mercaptoethanol for the rClu h 1 Mut., but not for the rSal s 1 Mut. However, we have been able to prove the presence of both parvalbumin mutants via western blot. Further optimization of the expression conditions for the three allergens and testing IgE-reactivity with patient sera could be of great importance for future immune therapies.

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