Bibliographic Metadata

Title
Methodenvergleich in der RAS-Mutationsanalyse beim metastasierten kolorektalen Karzinom
Additional Titles
Comparison of two methods for RAS mutation detection in metastatic colorectal carcinoma
AuthorBrar, Priska
Thesis advisorZahradnik, Michaela
Published2014
Date of SubmissionJune 2014
LanguageGerman
Document typeBachelor Thesis
Keywords (DE)Anti-EGFR-Therapie / Cetuximab / EGF-Rezeptor / KRAS / Metastasiertes kolorektales Karzinom / NRAS / Panitumumab / RAS / Real-Time-PCR / Sanger-Sequenzierung / Mutationsansanalyse
Keywords (EN)Anti-EGFR therapy / Cetuximab / EGF receptor / KRAS / Metastatic colorectal carcinoma / NRAS / Panitumumab / RAS / Real-Time-PCR / Sanger sequencing
Restriction-Information
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Classification
Abstract (German)

Jüngste Studien haben die Bedeutung von RAS-Mutationen als prädiktive Biomarker für das Ansprechen auf die Anti-EGFR-Therapie beim metastasierten kolorektalen Karzinom aufgezeigt. Die dafür eingesetzten monoklonalen Antikörper, wie Panitumumab oder Cetuximab, binden an den Wachstumsfaktorrezeptor (EGFR) auf den Tumorzellen und hemmen somit nachgeschaltete Signalwege. Tumore mit somatisch aktivierenden Mutationen in den KRAS- oder NRAS-Genen (Exons 2, 3 und 4) sprechen nicht auf diese Therapieform an, da mutierte RAS-Moleküle eine EGFR-unabhängige Aktivierung von Signalkaskaden bewirken, die zu unkontrolliertem Zellwachstum und Zellproliferation führen. Zur Bestimmung des KRAS-Mutationsstatus in den Exons 2 und 3 stehen validierte Methoden zur Verfügung und auch für die Analyse des Exons 4 von KRAS sowie der Exons 2, 3 und 4 von NRAS werden von Seiten der European Medicines Agency (EMA) validierte Tests gefordert. Eine Möglichkeit den RAS-Status zu bestimmen ist die DNA-Sequenz-Analyse nach Sanger, die auch die „Goldstandard“-Methode in der Mutationsanalyse darstellt. Ein Real-Time PCR Assay LightMix® Kit von der Firma TIB Molbiol (Germany) detektiert somatische Mutationen in den Exons 2, 3 und 4 von NRAS sowie im Exon 4 von KRAS und sollte im Zuge dieser Bachelorarbeit im molekularpathologischen Labor des Pathologisch-Bakteriologischen Instituts des Kaiser-Franz-Josef-Spitals evaluiert werden. Insgesamt wurden 131 archivierte Formalin fixiert und Paraffin eingebettete (FFPE)-Proben von Patienten/Patientinnen mit metastasiertem kolorektalem Karzinom aus den Jahren 2012 und 2013 mit beiden Methoden untersucht. Die Ergebnisse der Studie wurden in Hinblick auf Sensitivität und Spezifität miteinander verglichen. Außerdem wurden sowohl die Kosten als auch der Arbeits- und Zeitaufwand beider Verfahren einander gegenübergestellt. Im Vergleich zur Referenzmethode detektiert der LightMix® Kit Mutationen mit einer Sensitivität von 77% und Wildtypen mit einer Spezifität von 98%, ein statistisch signifikanter Unterschied zwischen den Methoden wurde nicht gefunden. Obwohl die Kosten-, Arbeits- und Zeitersparnis und die statistische Auswertung für den Routine-Einsatz des LightMix®-Kit sprechen, ist die Validierung dieses Assays aufgrund der abweichenden Mutationsergebnisse noch nicht abgeschlossen. Eine parallele Weiterführung beider Methoden zur RAS-Status-Erhebung ist in der Routine-Diagnostik notwendig, um falsch negative Ergebnisse auszuschließen und somit eine richtige Selektion der Patienten/Patientinnen mit mCRC, die von der Anti-EGFR-Therapie profitieren würden zu gewährleisten.

Abstract (English)

Recent studies have shown the importance of RAS mutations as predictive markers for the response to anti-epidermal growth factor receptor (EGFR) agents in metastatic colorectal cancer (mCRC). Due to somatic activating mutations in exon 2, 3 or 4 in the KRAS or NRAS genes patients cannot benefit from anti-EGFR therapeutics like Panitumumab or Cetuximab which bind the EGFR on tumor cells and thus inhibit downstream signaling pathways. Mutated RAS molecules cause an EGFR-independent activation of signaling cascades that leads to uncontrolled cell growth and cell proliferation. For the detection of mutations in KRAS exon 2 and 3 there are validated methods available. However, also for the determination of exon 4 of KRAS and exons 2, 3 and 4 of NRAS validated methods are required on the part of the European Medicines Agency (EMA). One way to detect somatic mutations is Sanger DNA sequencing which is also the gold standard method in mutation testing. A new real-time PCR assay LightMix® from TIB Molbiol (Germany) detects somatic mutations in NRAS exons 2, 3 and 4 and as well as KRAS exon 4 and should be evaluated for its routine use in the molecular pathological laboratory in the pathological-bacteriological institute of the “Kaiser-Franz-Josef-Spital”. A total of 131 archived formalin-fixed and paraffin embedded (FFPE) samples from patients with mCRC from the years 2012 and 2013 were examined by using both methods. The results of the study were compared to each other in terms of sensitivity and specificity. In addition differences in costs, time- and labor-effort were considered. The LightMix®-Kit showed a sensitivity of 77% and a specificity of 98%, a statistically significant difference between the two methods could not be found. The savings in costs, labor- and time-effort as well as the statistical analyses of the LightMix®-Kit recommend the use of the LightMix®-Kit in routine diagnostics to evaluate the RAS-status as a predictive marker. The validation of this assay due to different mutation detection results is not complete yet. To avoid false negative results and to ensure a correct selection of patients with mCRC who benefit from the anti-EGFR-therapy a parallel continuation of both methods is necessary.