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Title
Vergleichende Sekretomanalysen stark- und schwachtoxischer Bacillus cereus Isolate und Charakterisierung der Proteaseaktivität
Additional Titles
Comparative secretomeanalysis of high and low toxic Bacillus cereus isolates and characterization of the protease activity
AuthorKainz, Verena
Thesis advisorSchnabl, Christine
Published2014
Date of SubmissionJune 2014
LanguageGerman
Document typeBachelor Thesis
Keywords (DE)Bacillus cereus / Protease / SDS-PAGE / Zymographie
Keywords (EN)Bacillus cereus / protease / zymography / SDS-PAGE
Restriction-Information
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Classification
Abstract (German)

Diese Arbeit befasst sich mit ausgewählten enteropathogenen Bacillus cereus Stämmen, die aus verschiedenen Lebensmitteln und Faeces-Proben isoliert wurden. Die Bakterien sind weit verbreitet in der Natur und können sich leicht auf natürlichen Nahrungsmitteln ausbreiten. Sie werden in einer Vielzahl von Lebensmitteln nachgewiesen, wobei sie Auslöser einer Lebensmittelvergiftung sein können. Enteropathogene B. cereus bilden die bislang beschriebenen Enterotoxine Hämolysin BL, das nicht hämolytische Enterotoxin und Cytotoxin K, die Durchfall auslösen. Diese Toxine werden erst nach Aufnahme kontaminierter Nahrung im Körper gebildet. Die kodierenden Gene für Toxine können mittels PCR-basierter Nachweismethoden erfasst werden. Nachgewiesene Toxingene geben jedoch keinen Rückschluss über die tatsächlich gebildete Toxinmenge. Das Potential der Toxizität reicht von Stämmen, die als probiotische Bakterien eingesetzt werden, bis hin zu starktoxischen Stämmen, die für bereits vereinzelt aufgetretene Todesfälle verantwortlich sind. Für die Unterscheidung stark- und schwachtoxischer Stämme gibt es bislang jedoch keine geeignete Differenzierungsmöglichkeit.

Zur Entwicklung einer solchen Differenzierungsmöglichkeit werden Markerproteine für stark- bzw. schwachtoxische Stämme gesucht. Hierzu wird ein Stammset aus 19 Isolaten verschiedenen Ursprungs eingesetzt. Da alle bislang beschriebenen Virulenzfaktoren von B. cereus sekretiert werden, steht das Sekretom im Vordergrund der Analysen. Zum einen wurden die Exoproteomprofile der Faeces-Stämme mittels SDS-PAGE charakterisiert um eventuell vorhandene Markerproteine zur Differenzierung der Stämme zu detektieren.

Neueste Studien belegen, dass auch sekretierte Proteasen eine zentrale Rolle für die Virulenz von Bakterien spielen. Aus diesem Grund wurde im Rahmen dieser Arbeit auch die Proteaseaktivität des kompletten Stammsets untersucht. Durch Einsatz gelbasierter zymographischer Methoden wurde die proteolytische Aktivität der Isolate auf die Substrate Casein, Milchpulver und Gelatine jeweils 6 und 24 Stunden nach Inokulation analysiert.

Der Vergleich der Bandenmuster auf den Zymographiegelen zeigte eine Ähnlichkeit bei Stämmen mit gleichem Toxinprofil. Jedoch war kein Zusammenhang zwischen Toxizität und Proteaseaktivität erkennbar.

Die Exoproteomprofile der Faeces-Stämme variieren, es werden demnach verschiedene Proteine von den Stämmen sekretiert. Einige Proteinbanden werden bei nahezu allen Stämmen exprimiert, andere nur stammspezifisch. Mit Hilfe der in dieser Arbeit eingesetzten Methoden konnten bislang jedoch keine Markerproteine identifiziert werden, die spezifisch für stark- oder schwachtoxische Stämme sind. Jedoch sollte beachtet werden, dass die 1-dimensionale gelelektrophoretische Auftrennung nur begrenzte Möglichkeiten bietet. Für eine bessere Auflösung sollte eine 2-dimensionale Auftrennung eingesetzt werden, so können auch Doppelbanden identifiziert werden.

Abstract (English)

This thesis deals with selected enteropathogenic Bacillus cereus strains that were isolated from different food and faeces samples. The bacteria are widespread in nature and can easily spread to food. They are recorded in a variety of foods and they may be the cause of food poisoning. Enteropathogenic B. cereus form the described enterotoxins haemolysin BL, the nonhaemolytic enterotoxin and cytotoxin K. These toxins induce vomiting and they were formed in the body after ingestion of contaminated food. PCR-based detection methods can only detect the toxin encoding genes. Existing toxin genes give no conclusion about the amount of toxin. The potential toxicity ranges from strains, which are used as probiotic bacteria to highly toxic strains that are responsible for occurring cases of death. There is still no appropriate differentiation opportunity to distinguish between high and low toxic Bacillus cereus strains.

To develop a differentiation method, marker proteins for high and low toxic strains are required. For this purpose a strainset of 19 isolates from different origins is used. The secretome is the focus of analysis because all described virulence factors of B. cereus were secreted. First, the exoproteomeprofiles of the faeces samples were characterized by SDS-PAGE. The aim was to find marker proteins for the differentiation of high and low toxic strains.

The latest studies show that secreted proteases play a central role in the virulence of bacteria. For this reason, the protease activity of the complete strainset was analyzed.

The proteolytic activity of the isolates was distinguished 6 and 24 hours after inoculation with zymographic methods. Casein, milk powder and gelatin were used as substrates.

The comparison of the band patterns on the zymographygels showed a similarity in strains with the same toxin profile. However, no correlation between toxicity and protease activity was apparent.

The exoproteomeprofiles of the faeces strains vary. The strains secreted different proteins. Some protein bands are expressed in almost all strains, others are only strain specific. With the methods in this work no marker proteins have been identified that are specific to high or low toxic strains. It should be noted that the 1-dimensional gel electrophoretic separation only offers limited options. For a better separation, a 2-dimensional gel electrophoretic method should be used, as well as double bands can be identified.