Titelaufnahme

Titel
HLA-G Whole Gene Sequencing mittels Next Generation Sequencing am Ion Torrent™ Personal Genome Machine
Weitere Titel
HLA-G Whole Gene Sequencing by Next Generation Sequencing with the Ion Torrent™ Personal Genome Machine
AutorInnenNguyen, Anita Thu Huong
GutachterSeper, Helena
Erschienen2014
Datum der AbgabeJuni 2014
SpracheDeutsch
DokumenttypBachelorarbeit
Schlagwörter (DE)MHC Klasse Ib / HLA-G / Next-Generation Sequencing / Ion Torrent™ PGM / HLA-G Allele
Schlagwörter (EN)MHC class Ib / HLA-G / Next Generation Sequencing / Ion Torrent™ PGM / HLA-G alleles
Zugriffsbeschränkung
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Klassifikation
Zusammenfassung (Deutsch)

Diese Arbeit beschäftigt sich mit dem HLA (humanes Leukozyten Antigen)-G, einem nicht-klassischen MHC (Haupthistokompatibilitätskomplex) Klasse I, und der Sequenzierung von drei potentiell neuer Allele durch die Next-Generation Sequencing (NGS) Methode am Ion Torrent™ PGM. Das Ziel dieser Studie ist die Erhaltung der kompletten von 5‘ bis 3‘ UTR reichende Sequenz der neuen Allele.

HLA-G gehört zu den nicht-klassischen MHC Klasse I Molekülen und wird am kurzen Arm des Chromosoms 6 lokalisiert. Es unterscheidet sich von den klassischen MHC Klasse I Molekülen in seinem verkürzten, zytoplasmatischen Ende und seinem geringen Polymorphismus. Dieses wird physiologisch auf den Trophoblasten der Plazenta exprimiert und kann durch Interaktion mit inhibitorischen Rezeptoren die fetalen Zellen vor der Erkennung und Elimination durch das maternale Immunsystem schützen. Jedoch kann es ebenfalls in pathologischen Fällen, wie zum Beispiel Autoimmunerkrankungen, auftauchen.

Durch die NGS Methode am Ion Torrent™ PGM wurden die neuen Allele des HLA-G Genes von 5‘ bis 3’UTR sequenziert. Das Messprinzip des Ion Torrent™ PGM basiert auf einer pH-Wertänderung, die durch den Einbau einer Base und der dadurch resultierenden Abspaltung eines Protons hervorgerufen wird. Die Sequenzierung findet auf Semikonduktor Chip statt, die mindestens 1 Millionen Wells aufweist. Eine massiv parallele Sequenzierung wird durch die voneinander unabhängigen Wells gewährleistet, sowie auch eine Erhöhung des Probendurchsatzes durch die Markierung der DNA Fragmente mit Barcodes und Adaptoren. Eine klonale Amplifikation kann durch eine Emulsions-PCR stattfinden, da sich in den Mikroreaktoren lediglich ein Ion Sphere™, ein DNA Fragment und Sequenzierprimer befindet.

Durch diese Studie wurden zwei dieser drei potentiell neuen Allelen bestätigt.

Das „new1“ Allel ist bereits bekannt. Es handelt sich um das Nullallel HLA-G*01:05N.

Das „new2“ Allel unterscheidet sich von HLA-G*01:01:01:01 in drei Positionen im Exon 3. Denn an Pos. +933 weist dieses neue Allel Guanin, an Pos. +938 Cytosin und an Pos. +960 Cytosin auf.

Das „new3“ Allel weist Übereinstimmungen mit der Sequenz des Allels HLA-G*01:01:02:01 auf, außer in Pos. +2018 im Exon 5. An dieser Position weist dieses Allel eine Deletion auf.

Zusammenfassung (Englisch)

This thesis deals with the HLA (human leukocyte antigen)-G, a non-classical MHC (major histocompatibility complex) class I, and the sequencing of three potentially new alleles by the Next-Generation Sequencing (NGS) method on the Ion Torrent™ PGM. The aim of this study is to preserve the complete 5 ' to 3 ' UTR reaching sequence of the new alleles.

HLA-G is one of the non-classical MHC class I molecules and is located on the short arm of chromosome 6. It differs from the classical MHC class I molecules in its shortened cytoplasmic end and its low polymorphism. The HLA-G is expressed physiologically on the trophoblasts of the placenta and protects by interacting with inhibitory receptors the fetal cells from detection and elimination by the maternal immune system. However, it may also be expressed in pathological conditions such as autoimmune disease.

By using the NGS method on the Ion Torrent™ PGM was it possible to sequence the new alleles of the HLA-G gene from 5 ' to 3' UTR. The measuring principle of Ion Torrent™ PGM is based on a pH change, which is caused by the incorporation of a base and the resulting elimination of a proton. The sequencing process takes place on a semiconductor chip, which has at least one million wells. A massively parallel sequencing is guaranteed by the independent wells, as well as an increase in sample throughput, because the ligation of the DNA fragments with barcodes and adaptors. A clonal amplification is possible by the emulsion PCR, because the microreactors are only containing one Ion Sphere™, one DNA fragment and sequencing primers.

Due to this study two of these three potentially new alleles were confirmed.

The “new1” allele is already known. It is the null allele HLA-G*01:05N.

The " new2 " allele differs from HLA-G * 01:01:01:01 in three positions in exon 3. This new allele expulses at the position +933 guanine, at position +938 cytosine and at position +960 cytosine.

The " new3 " allele has similarities with the sequence of the allele HLA -G * 01:01:02:01, except in position +2018 in exon 5. At this position this allele has a deletion.

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