Titelaufnahme

Titel
Die Rolle der Makroautophagie in der Keratinozytendifferenzierung im Humansystem
Weitere Titel
The role of macroautophagy in keratinocyte differentiation of the human system
VerfasserSchrefl, Eva
GutachterFondi, Martina
Erschienen2014
Datum der AbgabeJuni 2014
SpracheDeutsch
DokumenttypBachelorarbeit
Schlagwörter (DE)Atg 7 / Autophagie / Epidermis / Gene silencing / Hautäquivalente / Hautbarriere / siRNA / Keratinozyten / Keratinozytendifferenzierung / Makroautophagie / Transfektion
Schlagwörter (EN)Atg 7 / autophagy / epidermis / gene silencing / skin equivalent / skin barrier / siRNA (small interfering RNA) / keratinocytes / keratinocyte differentiation / macroautophagy / transfection
Zugriffsbeschränkung
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Klassifikation
Zusammenfassung (Deutsch)

Einleitung: Die Entwicklung der menschlichen Haut endet mit der Verhornung durch die

Umwandlung der Keratinozyten (KC) zu abgeflachten, abgestorbenen und zellkernlosen

Korneozyten. Während dieses Verhornungsprozesses werden intrazelluläre

Komponenten durch lysosomale Enzyme eliminiert. Dieses Phänomen führte zu unserer

Annahme, dass die Autophagie am Differenzierungsprozess der KC beteiligt sein könnte.

Eine Vielzahl an Autophagie assoziierten Genen, wie beispielsweise das Atg7 Gen, sind

für den Ablauf der Autophagie essentiell. Während ein totaler Knockout von ATG7 in

Tierversuche mit Mäusen zu einem tödlichen Phänotyp führt, zeigen Mäuse, bei denen

ATG7 nur in KC ausgeschaltet wurde, eine normale Entwicklung der Epidermis und der

Hautbarriere. Da die Mausepidermis deutlich weniger Zellschichten aufweist als die

humane Haut, ist ein direkter Vergleich jedoch nicht immer möglich. Anhand der

Tierversuche können daher nur bedingt Rückschlüsse auf die Auswirkung des Atg7

Knock-downs im Humansystem gezogen werden.

Diese Studie untersucht anhand von primären KC-kulturen und eines in vitro Hautmodells

die Bedeutung der Makroautophagie für die KC-differenzierung sowie die Bildung einer

funktionellen Hautbarriere in einem humanen System.

Methoden: In der Zellkultur wurden KC aus humanem Hautgewebe isoliert. Die so

gewonnenen KC wurden mit Atg7 siRNAs transfiziert, wodurch das ATG7-Gen gezielt

ausgeschaltet wurde. Die KC-differenzierung wurde sowohl in 2-dimensionalen Kulturen,

induziert durch Kultur der KC bei 100% Konfluenz für mehrere Tage, als auch 3-

dimensionalen in vitro Hautmodellen untersucht. Von den Hautmodellen wurden

Präparate für die histologische Auswertung angefertigt. Auswirkungen auf die Autophagie

wurden mittels Western-blot Analysen von microtubule-associated protein light chain 3

(LC3) untersucht. Die KC-differenzierung wurde durch Analyse der

Differenzierungsmarker Loricrin, Involucrin, Filaggrin, Keratin-10, und Keratin-14

immunhistochemisch sowie mit Real-time PCR qualitativ und quantitativ untersucht. Die

Intaktheit der Hautbarriere wurde mittels eines Biotin-Diffusions-Assays analysiert. Alle

Experimente wurden mit 3 verschiedenen Hautspendern durchgeführt.

Ergebnisse: KC, bei denen die ATG7-Expression mittels siRNA stillgelegt wurde, zeigten

eine normale KC-differenzierung in 2-dimensionalen Kulturen. Im Hautmodell zeigte sich,

dass das Blockieren der ATG7 Expression zu keiner veränderten KC-differenzierung

führte. Außerdem bildete sich eine funktionsfähige Hautbarriere.

Conclusio: Unsere Daten deuten darauf hin, dass – ähnlich wie im Mausmodell – das

Fehlen von ATG7 keinen signifikanten Einfluss auf die KC-differenzierung und die

Bildung der Hautbarriere hat.

Zusammenfassung (Englisch)

Introduction: Skin development ends with the cornification of KC and the formation of

the epidermal barrier. During this process cell organelles and certain proteins are

degraded by lysosomal enzymes and recycled. This phenomenon, called autophagy, has

led to the hypothesis that it plays a major role in the differentiation of KC. A complete

knock-out of essential autophagy related genes such as Atg7 in the mouse system lead

to death immediately after birth. In contrast, it has been recently demonstrated that KC

specific deletion of Atg7 in the murine epidermis has no impact on survival as well as

cornification and the formation of the epidermal barrier. However, no data are available

until now, investigating the importance of autophagy for the development of the human

epidermis. In this study we tested the impact of Atg7 knock-down in a human in vitro skin

model to investigate whether or not autophagy plays a role in KC differentiation and

formation of a function epidermal barrier.

Methods: Atg7 was inactivated in human primary epidermal KC by transfection with Atg7

specific siRNAs. KC differentiation was investigated in 2-dimensional monolayer cultures

as well as in 3-dimensional in vitro skin models. Autophagic activity was detected by

western blot analysis using microtubule-associated protein light chain 3 (LC3) and p62.

Differentiation markers such as keratin14, keratin10, loricrin, involucrin and filaggrin were

analyzed by quantitative real-time PCR and qualitative with immunostainig. Epidermal

morphology was examined by histological analyses and barrier function was evaluated by

dye diffusion (biotin assay).

Results: ATG7 silenced human primary KC in monolayer cultures showed normal KC-

differentiation induced by confluency. ATG7 knock-down in an in vitro skin model showed

normal KC-differentiation and formation of a functional epidermal barrier.

Conclusion: In this study we could show that ATG7 depletion in human KC has no

significant influence on KC-differentiation, suggesting a minor role of autophagy for KC-

differentiation and the formation of a functional epidermal barrier.