Titelaufnahme

Titel
3D Zellkulturen auf denaturierten Knochenstücken
Weitere Titel
3D Cell Cultures On Denaturated Bone Chips
AutorInnenCeller, Nadine
Erschienen2015
Datum der AbgabeSeptember 2015
SpracheEnglisch
DokumenttypBachelorarbeit
Schlagwörter (DE)AlpI / Bglap2 / β-Glycerophosphat / Col1a1 / Genexpression / Knochenstücke / MC3T3-E1 / Ostoeblasten / Phospho1 / Runx2 / Saa3 / Sost / Tnsf11 / 3D-Zellkulturen
Schlagwörter (EN)AlpI / Bglap2 / β-glycerophosphate / Col1a1 / bone chips / gene expression / MC3T3-E1 / osteoblast / Phospho1 / Runx2 / Saa3 / scaffolds / Sost / Tnsf11 / 3D cell cultures
Zugriffsbeschränkung
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Klassifikation
Zusammenfassung (Deutsch)

Knochen sind ein wichtiger Bestandteil des menschlichen Körpers, aber auch jener vieler anderer Spezies. Sie sind in der Lage, bei Verletzungen ihr Gewebe zu regenerieren, jedoch können Krankheiten diesen Prozess entweder stark einschränken oder völlig verhindern. Aus diesem Grund wird oft auf Ersatzmaterialien zurückgegriffen, die dem Patienten implantiert werden und die Regeneration anregen. Diese müssen jedoch langwierigen Prüfungsprozessen unterzogen werden, um zu verstehen, wie sie mit dem Gewebe interagieren und um sie so anpassen zu können, dass bestmögliche medizinische Ergebnisse erzielt werden können.

Das Knochengewebe besteht aus verschiedenen Zelltypen, darunter Osteoblasten. Diese sind für verschiedene Prozesse im Knochengewebe zuständig, darunter der Knochenaufbau. Obwohl sie bereits in vitro unter verschiedenen Umgebungsbedingungen in 2D Zellkulturen untersucht wurden, gibt es noch viele Fragen, vor allem über ihr Verhalten in 3D Zellkulturen. Um mehr über die Interaktionen zwischen Osteoblasten und Knochenstücken herauszufinden, wurden im Folgenden präosteoblastische Zellen auf Knochenstücken kultiviert. Die Knochenstücke wurden entweder im Vorfeld denaturiert oder mit 70% EtOH sterilisiert. Das verwendete Zellmedium wurde in manchen Kulturen mit β-Glycerophosphat (β-GP) versetzt, während andere Kulturen völlig ohne β-GP kultiviert wurden. β-GP ist hierbei eine Substanz, die die Differenzierung in Osteoblasten anregen kann. Nach vier Wochen wurden die Genexpression der Kulturen mittels quantitativer Real Time Polymerase Kettenreaktion (qRT-PCR) der in cDNA revers transkribierten mRNA gemessen. Zudem wurden einige der kultivierten Knochenstücke gefärbt, sodass bei einigen Kulturen die Fluoreszenz der Zellkerne und Aktinfilamente mithilfe eines konfokales Laser Scanning Mikroskops detektiert werden konnte, während bei anderen Knochenstücken vor ihrer Zellkernfärbung mittels Giemsa eine Einbettung sowie eine Anfertigung von histologischen Schnitten erfolgte.

Die Vorbehandlung der Knochenstücke hatte dabei keine Auswirkung auf die Anordnung der besiedelten Zellen. Nichtsdestotrotz konnten Unterschiede in den Genexpressionen verschiedener osteoblastischer Genmarker festgestellt werden: Die Expressionen der 3D Zellkulturen zeigten in den meisten Fällen niedrigere Genexpressionen. Als Ausnahme hierbei galt Saa3, dessen Expression in Kulturen auf autoklavierten Knochenstücken höher war als in 2D Kontrollkulturen und in Kulturen auf sterilisierten Knochenstücken. Aufgrund der Tatsache, dass Saa3 mit immunologischen Reaktionen im Körper assoziiert wird, könnte eine erhöhte Expression darauf hindeuten, dass das Autoklavieren die Struktur der Knochenstücke verändert und die Zellen auf diese Art und Weise zu einer erhöhten Expression anregt.

Zusammenfassung (Englisch)

Bones make up one of the most important features of the body, not only in humans but also in many other species. Though they are able to regenerate to some extent, different diseases may inhibit or completely halt their regeneration process. In such situations the healing process can be improved or even restored by applications of certain replacement materials. These materials have to be studied and understood in their interactions with tissue specific cells in order to achieve the best medical results for the patients. In normal bone tissue, osteoblasts are found in a high number, being responsible for different processes occurring in bone tissue. Though they already have been observed in vitro under different conditions in 2D culture systems, many things are left unknown about them, especially about their behaviour in 3D cultures and their interactions with replacement materials.

In order to learn more about osteoblasts in 3D cultures, murine pre-osteoblastic cells were cultured on deactivated bone chips. While the bone chips were either denaturized or sterilized with 70% EtOH, the cell medium either did or did not contain β-glycerophosphate (β-GP), a substance which indicates differentiation in cells. After 4 weeks of culturing, the gene expression of specific genes occurring in osteoblasts was determined by first isolating the RNA and reverse transcribing it into cDNA in order to be able to perform quantitative Real Time Polymerase Chain Reaction (qRT-PCR). Also, some of the cultured bone chips were used for fluorescent staining of the cell nuclei and actin filaments, before further observed via confocal laser scanning microscopy or embedded, cut into sections and stained with Giemsa.

Although there were no visible differences observed between the cellular arrangements of osteoblasts on autoclaved and ethanol treated bone chips, the expression rates of different genes in 3D cell cultures showed significant differences in form of a lower gene expression in most tested cases. The only exception concerning the gene expression occurred in Saa3, a gene which was expressed at a higher rate in 3D cell cultures on autoclaved bone chips than in the reference 2D cell cultures and in 3D cell cultures on ethanol sterilized bone chips. Since Saa3 is known to be a factor relevant in immune responses, the higher expression may indicate that the autoclaving of bone chips change the bone chip structure and consequently cause the cells to increase the Saa3 expression rate. Though further observations in this case of matter are necessary, these results may help to understand more about the behaviour of osteoblasts in 3D cultures.