Titelaufnahme

Titel
Identifizierung und Analyse von Mutationen im Interface von leichter und schwerer Kette zur Erstellung heterodimerer IgG.
Weitere Titel
Identification and analysis of mutations in the interface of light and heavy chain for the generation of heterodimeric IgG.
VerfasserHagen, Hannes Georg
Erschienen2015
Datum der AbgabeJuli 2015
SpracheEnglisch
DokumenttypBachelorarbeit
Schlagwörter (DE)Bispezifische Antikörper / Protein Engineering / IgG / FACS
Schlagwörter (EN)Bispecific antibodies / protein engineering / IgG / FACS
Zugriffsbeschränkung
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Klassifikation
Zusammenfassung (Deutsch)

Das Design eines kompletten bispezifischen Antikörpers beschäftigt Wissenschaftler schon seit Jahrzehnten. Durch ihre einzigartigen Eigenschaften die aus der Bindung von zwei verschiedenen Antigenen und einem funktionellen Fc-Fragment resultieren haben sie ein großes Interesse geweckt. Ziel dieser Arbeit ist mittels Gen-Bibliothek eine Kombination von Mutationen zu identifizieren die eine korrekte Paarung von leichter zu schwerer Kette erhöhen und so zu einem bispezifischen Konstrukt führen. Die Co-Expression unveränderter Ketten führt zur Bildung vieler Nebenprodukte und nur einer geringen Menge des gewünschten Produkts. Durch Berechnung von Bindungsenergien im Interface zwischen konstanter leichter und schwerer Kette wurden 3 Positionen auf der konstanten leichten Domänefür einefür eine Gen-Bibliothek ausgewählt. Diese drei sollen mit einer zuvor ausgewählten Mutation auf der schweren Kette interagieren, welche eine schwächende Wirkung auf das Interface zwischen schwerer und leichter Kette hat. Bestimmte Kombinationen von Mutationen sollen die Paarung von schwerer zu leichter Kette wieder verstärken und zu einer Erhöhung der Expression führen. Um eingeführte Mutationen als Effekte wahrzunehmen wurde eine zuvor publizierte Mutation in das Interface der variablen Domänen eingeführt. Diese soll die dominante Paarung zwischen den Variablen Domänen schwächen. Der Beweise dieser Annahme wurde durch ein Expressionsexperiment und anschließende Messung der Expression mittels ELISA erbracht. Durch eine moderne Methode, die das Präsentieren der Antikörper auf der Zelloberfläche der HEK Zellen ermöglicht, können hoch-exprimierende Zellen mittels FACS aussortiert werden. Mehrere Sortierungsrunden sollen eine Anreicherung eines oder mehrerer gut exprimierbarer Konstrukte herbeiführen. Die erhöhte Expression resultiert aus einer stärkeren Bindung von leichter zu schwerer Kette, so unsere Annahme. Die Bibliothek wurde an einem monospezifischen 3D6 IgG getestet. Ein Sandwich-ELISA wurde für zukünftige Tests von bispezifischen Molekülen etabliert. Durch Kombination zweier Antigene konnten bispezifische Konstrukte gebunden und so korrekte Paarung der Ketten und schließlich Expression überprüft werdenExpressionsraten relativ verglichen werden. Außerdem war es möglich die erstellte Bibliothek einmal mittels FACS auszuwerten um mögliche Mutationen anzureichern die eine erhöhte Expression zeigen. Anschließend hätten diese Mutationen charakterisiert und auf ein bispezifisches Format adaptiert werden können. Die verwendeten Mutationen sollen dort die richtige Paarung der Ketten erleichtern um das gewünschte Molekül in erhöhter Menge produzieren zu können, ohne Nebenprodukte zu verursachen.

Zusammenfassung (Englisch)

The creation of a complete bispecific heterodimeric IgG occupied many researchers in the past decades. Due to its unique properties combining binding of two different targets with Fc-mediated effector functions the bispecific IgG has attracted certain interest. In a library approach we aim to identify mutants that allow to direct correct pairing of heavy and light chain in a bispecific construct. Incorrect pairing results in production of a wide range of byproducts diminishing the yield of the desired construct. With calculation of binding energies of certain positions in the CH - VH interface we choose to mutate three amino acids on the constant domain of the light chain. The three positions are predicted to be interacting with a previous identified position on the constant heavy chain that weakens the interface between heavy and light chain. Certain combinations of amino acids should direct a stronger interaction between the two chains and lead to an increase of expression. To see the effect of introduced mutations first a previously published mutation was introduced to weaken the interface of variable domains. The need of this mutation was demonstrated by expression in HEK cells and quantitation using ELISA. With a novel display method the candidates generated by the library approach are captured on mammalian cells and sorted through FACS. Several rounds of sorting give the opportunity to identify one or several combinations that give the best expression resulting from a strong interaction between heavy and light chain. The whole library approach was achieved using a monospecific format of human 3D6 IgG. Although we were not able to enrich a certain candidate due to lack of time a bispecific ELISA for detection of the bispecific product has been established for future needs. Using two different antigens in a sandwich like build up, we were able to compare the expression rates of already existing candidates. The first round of sorting resulted in a tiny shift of the overall population although the enrichment was not significant. Future steps would be several more rounds of sorting, and characterization of the identified mutations. Since the used positions are conserved they could be adapted to a bispecific format directing the correct pairing between heavy and light chains.