Titelaufnahme

Titel
Generierung eines ES-Zell-Kultursystems zur Identifikation von Tyk2 Interaktionspartnern
Weitere Titel
Generation of an ES cell culture system for identification of Tyk2 interaction partners
VerfasserKolmer, Benedict
Erschienen2015
Datum der AbgabeJuli 2015
SpracheDeutsch
DokumenttypBachelorarbeit
Schlagwörter (DE)Tyk2 / Tyk2 Interaktionspartner / Genexpressionsanalyse / Proteinanalyse / STAT1 Isoformen
Schlagwörter (EN)Tyk2 / Tyk2 interaction partners / gene expression profiling / protein profiling / STAT1 isoforms
Zugriffsbeschränkung
 _
Klassifikation
Zusammenfassung (Deutsch)

Tyrosinkinase 2 (Tyk2) spielt eine wesentliche Rolle bei der Abwehr von Infektionen und der Tumorüberwachung. Unser Ziel ist es, die Tyk2 Interaktionspartner in verschiedenen Geweben und Zelltypen zu analysieren. Dafür wurden embryonale Stammzellen (ES-Zellen) mit einem Tyk2 knock-in Konstrukt transfiziert um eine stabile Expression von Tyk2 zu ermöglichen. Tyk2-negative embryonale Maus-Fibroblasten (MEF) wurden mit einem Tyk2-Avitag und einem zweiten, die Biotin-Protein-Ligase BirA exprimierenden Konstrukt transfiziert, um die Bindung von Interaktionspartnern ohne den Hintergrund der durch das endogene Tyk2 gebundenen Proteine zu analysieren. Die murine Makrophagen Zelllinie RAW 264.7 wurde wegen ihrer einfachen Handhabung und Transfektion ebenso verwendet um einen Proteinkomplex Pull-down zu etablieren. Transfizierte Klone von MEF und RAW 264.7 Zellen wurden erzeugt, ihre Tyk2-Expressionslevels und Insertionsstellen werden getestet und aus den mittels Pull-Down Assay isolierten biotinlyierten Proteinkomplexen sollen Tyk2 Interaktionspartner identifiziert werden. Tyk2 rekombinierte ES Zellklone wurden erzeugt, stabil exprimierende Klone werden für Blastozysteninjektionen verwendet werden und die resultierenden transgenen Mäuse mit ROSABirA Mäusen gekreuzt werden, um in den Folgegenerationen aus den biotinylierten Tyk2-Proteinkomplexen Tyk2 Interaktionspartner in vivo bestimmen zu können.

Im Zuge der Etablierung eines Systems zur Analyse von Gen- und Proteinexpression in isolierten Populationen von myeloiden Vorläuferzellpopulationen wurden Isolierungs- und FACS–Prozesse zur Steigerung der Ausbeute optimiert. In den isolierten Zellpopulationen wurde die Gen- und Proteinexpression der Stat1 Isoformen mittels quantitativer real-time PCR und western blot bestimmt.

Zusammenfassung (Englisch)

Tyk2 has a vital role in immunity to infection and tumor surveillance in various cell types. The project aims to identify its diverse interaction partners in different tissues and cell types. For this purpose, cultivation of embryonic stem cells (ES) and transfection with an expression vector for stable Tyk2 expression was established. Murine embryonic fibroblasts (MEF) lacking Tyk2 as well as murine macrophage cell line RAW 264.7 were transfected with two constructs containing Tyk2-Avitag and biotin protein ligase BirA, Tyk2-/- MEF were utilized to increase binding of potential interaction partners to expressed Tyk2 protein by eliminating binding to endogenous Tyk2. RAW 264.7 were utilized for their easy handling and transfection and for establishing protein-complex pull-downs. Transfected clones of MEF and RAW 264.7 were established, Tyk2-expression as well as stable integration will be determined and biotinylated Tyk2 interaction partners from protein complexes, isolated by pull-down assays, were biochemically characterized. Clones of transfected ES cells have been created and will be used for blastocyst injections to generate transgenic mice which will be crossed with ROSABirA mice for in vivo investigation of Tyk2 interaction partners.

In order to establish a system for analyzing gene expression and protein levels in isolated populations of less frequent myeloid progenitor cells, we optimized isolation and FACS conditions to obtain a high yield of progenitors. We analyzed gene- and proteinexpression of Stat1 isoforms by quantitative real-time PCR and western blot.