Titelaufnahme

Titel
Etablierung eines Phagenscreenings zur Identifizierung von Transposon-Insertionsstellen in Salmonella Typhimurium
Weitere Titel
Establishment of a Bacteriophage Screening to Identify Transposon Insertion Sites in Salmonella Typhimurium
AutorInnenMaurer, Sigrun
Erschienen2015
Datum der AbgabeJuli 2015
SpracheDeutsch
DokumenttypBachelorarbeit
Schlagwörter (DE)Salmonella / Bakteriophage / Proteinaufreinigung / Zufallsmutagenese / Transposon
Schlagwörter (EN)Salmonella / Bakteriophage / Protein purification / Random mutagenesis / Transposon
Zugriffsbeschränkung
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Klassifikation
Zusammenfassung (Deutsch)

Salmonella Typhimurium ist ein motiles, gram-negatives enteropathogenes Bakterium, welches Flagellen zur gerichteten Bewegung im Wirt verwendet und letztlich eukaryotische Zellen infiziert. Um den Infektionsprozess besser zu verstehen, werden Virulenzfaktoren und ihre Regulatoren untersucht, welche nach ihrer Identifizierung charakterisiert werden müssen. Eine weit verbreitete genetische Methode hierfür ist die Transposon (T-POP3) -Mutagenese, mit deren Hilfe zufällige Mutationen in das Genom eingefügt werden können. Mutationen mit abweichendem Phänotyp werden genauer untersucht, indem die Transposon-Insertionsstellen lokalisiert und identifiziert werden. Eine Möglichkeit zur unkomplizierten Lokalisierung stellt hierbei die Verwendung einer Phagen-Bibliothek dar, was auch als Phagenscreening bezeichnet wird.

In diesem Projekt wurde ein solches Phagen-Screening etabliert. Dazu wurde zunächst das Tail Gen des Phagen P22 in den Überexpressionsvektor pSUMO kloniert. Anschließend wurde das Tail Protein überexprimiert und mittels His6-Tag aufgereinigt. Mithilfe des gereinigten Proteins konnten schließlich funktionelle Phagen für die Phagen-Bibliothek hergestellt werden. Die Bibliothek ermöglicht die rasche Zuordnung der Insertion zu einer ungefähren Region im Genom, was die weitere Bearbeitung der jeweiligen genetischen Fragestellung erleichtert.

Diese Methodik der Lokalisierung wurde anschließend auf eine im Rahmen des Projektes durchgeführte Zufallsmutagenese angewandt, um die Effektivität der Phagenbibliothek zu analysieren und neue Erkenntnisse über einen konkreten Regulationsmechanismus zu gewinnen. Die flagellare Biosynthese in S. Typhimurium wird durch das Master Operon flhDC kontrolliert. Dieses wird durch FliA entweder direkt oder indirekt inhibiert. FliA ist ein Sigma Faktor, der in der Regulation von Genen involviert ist, welche für das Filament, für Chemotaxisproteine bzw. Motorkomponenten kodieren. Um dieses Regulationsnetzwerk näher zu analysieren, wurde eine T-POP3 Zufallsmutagenese durchgeführt und die Insertionsstelle des Transposons mithilfe der erstellten Phagenbibliothek, sowie mittels Arbitrary PCR und Sequenzierung lokalisiert. Das Screening und die anschließende Sequenzierung ergaben yifA und lrhA als potentielle Kandidaten für die mittelbare Inhibition von flhDC durch FliA.

Zusammenfassung (Englisch)

Salmonella Typhimurium is a motile, gram-negative enteropathogenic bacterium, which infects eukaryotic cells. It utilizes flagella for directional movement towards the infection site. In order to better understand the infection process, virulence factors and their regulators are investigated and further characterised. A widely used genetic method for this purpose is the transposon (T-POP3) mutagenesis, by means of which random mutations are inserted into the genome. Mutations which lead to altered phenotypes are then examined more closely through identification and localisation of the T-POP3 insertion sites. An uncomplicated method for localising these insertions is the use of a phage library, also called phage screening.

In the course of this project such a phage screening was established. First the tail gene of phage P22 was cloned into the overexpression plasmid pSUMO. After that the protein was overexpressed and purified via His6-tag. With the purified protein it was possible to produce functional phages for the phage library. This library allows the swift, approximate localisation of transposon insertion sites in the genome, which facilitates further investigations into the genetic question at hand.

In order to determine the effectivity of the established phage screening, a random mutagenesis was conducted during this project. The flagellar biosynthesis of S. Typhimurium is under the control of the master operon flhDC which is directly or indirectly repressed by FliA. FliA is a sigma factor involved in the regulation of genes encoding for the filament, chemotaxis proteins or motor-force generating proteins. To investigate this regulatory process, a T-POP3 random mutagenesis was performed. Afterwards the insertion sites were localised using the phage library as well as arbitrary PCR and sequencing. The screening and the subsequent sequencing identified yifA and lrhA as potential candidates for the indirect negative regulation of flhDC through FliA.

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