Titelaufnahme

Titel
Identifizierung von neuen Fisch-Allergenen in heimischen Fischarten
Weitere Titel
Identification of novel fish-allergens in fish species common in Austria
VerfasserMayrhofer, Patrick
GutachterSwoboda, Ines
Erschienen2015
Datum der AbgabeJuli 2015
SpracheEnglisch
DokumenttypBachelorarbeit
Schlagwörter (DE)Allergien / Fisch / Parvalbumin / Enolase / Aldolase / Collagen / Western Blot / Massenspektrometrie / Patienten Seren
Schlagwörter (EN)Allergies / Fish / Parvalbumin / Enolase / Aldolase / Collagen / Western Blot / Mass spectrometry / Patienten sera
Zugriffsbeschränkung
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Klassifikation
Zusammenfassung (Deutsch)

In den letzten Jahren wurden zusätzlich zum Fisch-Hauptallergen, Parvalbumin, noch weitere Allergene in diversen Salzwasserfischen nachgewiesen. Ziel dieses Projekts war es, neue Fischallergene auch in heimischen Süßwasser-Fischarten zu identifizieren. Für diesen Zweck wurden Proteinextrakte aus rohem und gekochtem Forellen-, Karpfen- und Welsfleisch hergestellt. Anschließend wurde die Proteinkonzentration der Exktrakte mittels Bradfordmethode bestimmt und die Qualität der Extrakte auf denaturierenden Proteingelen evaluiert. Neben einer Proteinbande von ca. 13 kDa, bei der es sich vermutlich um Parvalbumin handelt, waren auf den Coomassie gefärbeten SDS-PAGE Gelen mehrere Proteinbanden im Bereich von 15 bis 170kDa zu sehen. Immunoblots, die mit einem gegen Karpfen Parvalbumin gerichteten Kaninchenserum (anti-Cyp c 1 wildtyp IgG) durchgeführt wurden, bestätigten das Vorhandensein von Parvalbumin in sämtlichen Extrakten. IgE Immunblots mit Patientenseren von Fischallergikern zeigten, dass die Patienten nicht nur mit Parvalbuminen, sondern auch mit höher molekularen Allergenen reagierten. Durch massenspektrometrische Analyse wurden unter diesen höher molekularen Banden Collagen type I alpha 1 und Collagen type I alpha 2, als neue Allergene in gekochtem Forellen-, Karpfen- und Welsfleisch identifiziert. IgE Inhibitionsblots zeigten weiters, dass zwischen den hochmolekularen Allergenen in Karpfen, Forelle und Wels Kreuzreaktivität besteht. Weiters wurde versucht, die cDNA des neu identifizierten Allergens, Collagen type I alpha 1, aus Karpfen zu klonieren. Hierfür wurde eine Reverse Transkriptase-Poylmerase Kettenreaktion (RT-PCR) mit einer bereits im Labor vorhandenen Karpfen-RNA mit Collagen type I alpha 1 spezifischen Primern durchgeführt. Während eine als Kontrolle durchgeführt RT-PCR mit Parvalbumin-spezifischen Primern zur Isolierung von Parvalbumin cDNA führte, konnte die für Collagen type I alpha 1 kodierende cDNA nicht isoliert werden. Der Grund hierfür dürfte darin liegen, dass die Collagen type I alpha 1 cDNA eine Länge von mehr als 4000 bp hat und die RT-PCR Bedingungen zur Isolierung einer so großen cDNA noch weiter optimiert werden müssten.

Zusammenfassung (Englisch)

In addition to the the major fish allergen, parvalbumin, several new fish allergens, have been discovered in variouse salt water fish species in recent years. The aim of this thesis is to identify novel fish allergens in fresh water fish species common in Austria. For this purpose, protein extracts from raw and cooked trout-, carp- and catfish meat were prepared. The protein concentration was determined using the Bradford method and the quality of the protein extracts was evaluated on denaturing protein gels. Besides proteinbands at 13kDa, which most likely represent parvalbumins, other protein bands in the range from 15 to 170kDa were visible on the Coomassie stained SDS-PAGEs. Immunoblots performed with a rabbit antiserum directed against carp parvalbumin (anti-Cyp c 1 wildtype IgG) proved the presence of parvalbumin in all extracts. IgE immunoblots performed with sera from fish allergic patients showed that the patients did not only react with parvalbumins, but also with higher molecular weight allergens. Mass spectrometry analyses enabled to identify among these higher molecular weight allergens collagen type I alpha 1 and collagen type I alpha 2 as novel allergens in cooked trout-, carp- and catfish meat. IgE inhibition immunoblots further showed cross-reactivity among the high molecular weight allergens of trout, carp and catfish. In addition, it was also attempted to clone the cDNA of the newly identified allergen collagen type I alpha 1, from carp. For this, a reverse transcriptionpolymerase chain reaction (RT-PCR) with a carp RNA already present in the laboratory and collagen type I alpha 1 specific primers was performed. Although a control RT-PCR with carp parvalbumin specific primers resulted in the isolation of carp parvalbumin cDNA, a cDNA coding for collagen type I alpha 1 could not be successfully isolated. The reason for this could be that collagen type I alpha 1 cDNA has a length of 4000bp and that for RT-PCR cloning of a cDNA of such a length the RT-PCR conditions would need further optimisation.