Titelaufnahme

Titel
Grundlagen zur biochemischen Characterisierung von(Zytosin-5)RNA Methyltransferasen(RZMTs): Reinigung von rekombinanten RZMTs zur Antikörperproduktion
Weitere Titel
Towards the biochemical characterisation of (cytosine-5) RNA methyltransferases (RCMTs): Purification of recombinant RCMTs for antibody production
VerfasserPolak, Alexander
Erschienen2015
Datum der AbgabeJuli 2015
SpracheEnglisch
DokumenttypBachelorarbeit
Schlagwörter (DE)RZMTs / RNA Methyltransferasen / 5-Methyl-cytosin / NSun2 / Dnmt2
Schlagwörter (EN)RCMTs / RNA methyltranferases / 5-methylcytosine / NSun2 / Dnmt2
Zugriffsbeschränkung
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Klassifikation
Zusammenfassung (Deutsch)

(Cytosin-5) Methylierung ist eine häufig auftretende Modifikation in DNA und ist wichtig für grundlegende biologische Prozesse, wie beispielsweise dem Schutz vor Bakteriophagen in Prokaryoten oder der Regulierung der Genexpression in Eukaryoten. 5-Methyl-cytosin (m5C) ist auch eine Modifikation in RNA, überwiegend in nicht-kodierenden RNAs. Der biologische Zweck dieser Modifikationen wird vermehrt mit der Regulierung der Proteinexpression und der Stressantwort in Verbindung gebracht. Verantwortlich für die Modifikation in RNA sind Cytosin-5 RNA Methyltransferasen (RCMTs), die in Drosophila jedoch noch nicht gut charakterisiert sind.

Ziel dieses Projekts war die Klonierung und Reinigung aller in Drosophila exprimierten RCMTs (NSun1, 2,4,5,6 und Dnmt2), für die enzymatische Charakterisierung und der Produktion von Antikörpern. Expressionsvektoren und Methoden (beispielsweise in vitro Methylierung und Analyse mittels Bisulfite-Sequenzierung) sollen etabliert werden, die die Charakterisierung der RCMTs in Drosophila und die Reinigung von rekombinantem Protein möglich machen. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen jedoch, dass die Expression von RCMTs in Bakterien schwierig ist. Es wurden schwerwiegende Probleme bei der Klonierung und Expression festgestellt, was darauf hinweist, dass die verwendeten Bakterienstämme die klonierten Gene nicht tolerieren.

Im Laufe des Projekts konnte rekombinantes NSun2 Protein exprimiert werden. Jedoch war die Ausbeute nach der Reinigung unter denaturierenden Bedingungen so gering, dass kein Methylierungsexperiment mit NSun2 durchgeführt werden konnte. Alternativ wurde ein Experiment mit rekombinantem Dnmt2 und gereinigter tRNA durchgeführt, welches die Analyse von Dnmt2-bedingter Methylierung in vitro mittel RNA Bisulfite-Sequenzierung etablierte.

Zusammenfassung (Englisch)

(Cytosine-5) methylation is a common modification of DNA. This modification is important for fundamental biological processes such as the defence against bacteriophages in prokaryotes and gene expression regulation in eukaryotes. 5-methyl cytosine (m5C) is also present in RNA, predominantly in non-coding RNAs. Its biological functions are mostly related to stress responses and the regulation of protein expression. Responsible for m5C modifications in RNA are (cytosine-5) RNA methyltransferases (RCMTs), which are not well characterised in Drosophila.

This project aimed at the cloning and purification of all RCMTs in Drosophila, which expresses six RCMT family members (NSun1, 2, 4, 5, 6 and Dnmt2). The goal was to establish expression vectors and methods (for example, in vitro methylation analysis by RNA bisulfite sequencing) that will allow the enzymatic characterization of Drosophila RCMTs and purification of recombinant RCMTs for antibody production in the near future. The results of this work indicate that bacterial expression of recombinant RCMT is not straightforward. Major problems with cloning and expression of various RCMTs were observed (for example, loss of RCMT containing vectors from large scale bacterial cultures, insolubility of expressed RCMTs) suggesting that recombinant eukaryotic RCMT expression is not well tolerated by the used bacterial expression systems.

In the course of this work, recombinant NSun2 protein could be expressed in bacteria. However, only low yields of NSun2 protein could be obtained after purification under denaturing conditions, which precluded the use of recombinant NSun2 in in vitro methylation assays. Alternatively, using recombinant Dnmt2 protein on purified RNA substrates allowed establishing a method that determines RCMT-mediated (cytosine-5) methylation efficiencies by using RNA bisulfite sequencing in an in vitro methylation assay.