Titelaufnahme

Titel
Charakterisierung von SNPs in GV Maissorten
Weitere Titel
Characterization of SNPs in GM maize varieties
VerfasserRaskovic, Marko
Erschienen2015
Datum der AbgabeJuli 2015
SpracheDeutsch
DokumenttypBachelorarbeit
Schlagwörter (DE)Varietät / GV-Mais / Ct / Konfidenzwerte / Mutation / SNP / heterozygot / HRM / Real-time PCR / PCR / Schmelzpunktkurve / Primer / NK603 / MON810
Schlagwörter (EN)HRM-Analysis / SNP / PCR / Real-time PCR / GM / NK603 / MON810 / Hybrid RR2/Bt / High Resolution Melting
Zugriffsbeschränkung
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Klassifikation
Zusammenfassung (Deutsch)

Im Rahmen des Bachelorpraktikums wurden zwei Projekte durchgeführt: Im Zuge des ersten Projekts wurde die genetische Stabilität von gentechnisch verändertem Mais bei Hybrid 631 RR2/Bt (MON810 x NK603) mithilfe der HRM (High Resolution Melting)-Analyse überprüft. Der zweite Ansatz befasste sich mit der Austestung von zuvor entwickelten mutationsspezifischen Primern für einen Single Nucleotide Polymorphism (SNP) an der Stelle 71 in der kodierenden Region des MON810-Transgens.

Die Erstzulassung von gentechnisch veränderten Organismen (GVO) kam im Jahr 1997 zustande. Seitdem steigt die Anzahl von zugelassenen GVO-Events kontinuierlich an. Die GVO-Konstrukte bei GV-Pflanzen müssen laut der Freisetzungsrichtlinie 2001/18/EC genetisch stabil sein. Das heißt, in den GVO-Produkten dürfen keine Veränderungen der genetisch modifizierten Eigenschaften auftreten. Für diese Untersuchungen werden nur wenige GVO-Proben kontrolliert bzw. mittels Southern Blot-Methode (siehe unter 4.1.) überprüft, die zudem nicht für die Identifizierung von SNPs geeignet ist.

Im Hinblick darauf kam Real-Time PCR mit anschließender Analyse, zur Anwendung die auch kleinste DNA-Veränderungen erkennen kann. Dafür extrahierte man aus insgesamt 200 GV-Maiskörnern die DNA mit der in weiterer Folge ein Screening mittels HRM-Analyse an ausgewählten Regionen durchgeführt wurde. Proben mit niedrigen Konfidenzwerten, also jene die (von der Referenzprobe) am stärksten abwichen, wurden sequenziert. Die Sequenzierungsergebnisse ergaben, dass SNPs in insgesamt neun Proben des MON810-Events vorhanden waren, während in NK603 keine Mutationen detektiert wurden.

Im zweiten Teil der Bachelorarbeit wurden mutationsspezifische Primer und Wildtyp-Primer mittels Real-Time PCR und HRM-Analyse auf ihre Funktionsfähigkeit getestet. Ziel war es, herauszufinden ob diese zwei Primer-Typen spezifisch binden. Dafür mussten Wildtyp- und SNP-Plasmide aus dem GV-Mais kloniert werden. Im Falle einer Mutation an Stelle 71 von 3`MON810 sollte der mutationsspezifische Primer, jedoch nicht der Wildtyp-Primer binden und vice versa. In dieser Untersuchung konnten weder mutationsspez.-Primer, noch Wildtyp-Primer spezifisch binden. Da beide Primertypen sowohl an Wildtyp- als auch an SNP-Plasmiden gebunden haben.

Zusammenfassung (Englisch)

As part of the bachelor thesis two projects were conducted. The first project verified the genetic stability of the genetically modified maize variety hybrid 631 RR2 / Bt (MON810 x NK603) using the HRM-method. The aim of the second experiment was testing of mutation-specific primers. Those primers were previously developed to bind only at the position 71 of 3`MON810 transgene. The position 71 shows a single nucleotide polymorphism (SNP).

First genetically modified organisms (GMOs) were authorized in 1997 and since then the number of permitted GMO events has been increasing. According to guideline 2001/18/EC, GMO constructs in GM crops have to be genetically stable. Therefore, the properties of GMO products have to stay unaltered. Nevertheless, only few GMO samples of products are controlled by Southern blot analysis. Unfortunately, Southern blot is not suitable for the identification of SNPs.

Real-time PCR and HRM (High Resolution Melting) analysis were used to achieve more significant results, because this method is able to detect smallest DNA sequence changes. The DNA was extracted from 200 GM maize grains. Selected regions of the extracted DNA were screened by HRM analysis. Samples with a low confidence value were sequenced. The results of the sequencing showed SNPs in 9 samples of MON810 event. No SNPs were detected in NK603.

The second part of this thesis tested the operability of mutation-specific primers and wild-type primers using real-time PCR and HRM-analysis. The goal was to find out, if these two primer types are binding specifically. Therefore, plasmids of the wild-type and SNP had to be cloned. Mutation specific primer (and not wild-type primer) should only bind in the case of a mutation at the position 71 of 3`MON810 and vice versa. It was revealed that the primer binds unselectively. Both primer binds on both types, wildtype- and SNP-plasmid.