Titelaufnahme

Titel
Detektion von Antibiotikaresistenzen in Speichelproben für Point-of-Care Anwendungen
Weitere Titel
Detection of Antibiotic Resistances in Saliva Samples for Point-of-Care Applications
VerfasserWierzbicki, Filip
Erschienen2015
Datum der AbgabeSeptember 2015
SpracheDeutsch
DokumenttypBachelorarbeit
Schlagwörter (DE)Antibiotikaresistenzen / DNA-Amplifikation / Speichel / Proteine / Detektion
Schlagwörter (EN)antibiotic-resistance / DNA-amplification / saliva / proteins / detection
Zugriffsbeschränkung
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Klassifikation
Zusammenfassung (Deutsch)

In dieser Arbeit wurden Vorversuche zur Entwicklung eines Detektionssystems von Genabschnitten im menschlichen Speichel für Point of Care-Anwendungen getätigt. Dazu wurde Speichel auf seine DNA- und Proteinkonzentration untersucht, anschließend wurde die Amplifikation des zu detektierenden Genabschnittes beobachtet. DNA wurde mittels Ethanolfällung und RNase-Verdau aus Speichel aufgereinigt und über die Absorption bei 260/280nm im Photometer gemessen. Dabei wurde eine durchschnittliche DNA-Konzentration von 3914,5 ng/100µl Speichel mit Standardabweichung +/- 2362,6 ermittelt.

Die durchschnittliche Absorption des Speichels im Bicinchoninsäure-Assay ergab 3,5. Da für die Ermittlung realer Proteinkonzentrationen des Speichels bovines Serumalbumin als Standard nicht ausreichte, wurden Verdünnungsreihen der häufigsten Speichelproteine(Muzine, α-Amylase, Albumin, IgA, Cystatin S und Lysozym C) aufgenommen. Die Standardreihen zeigten deutliche Unterschiede in der Absorption. Fokus der Arbeit war der Vergleich zwischen Polymerase-Kettenreaktion(PCR) und der Recombinase Polymerase Amplifikation(RPA). Dafür wurden synthetische DNA-Sequenzen der antibiotikaresistenz-tragenden Gene mecA und vanA, welche in Staphylococcus Aureus vorkommen, als Verdünnungen in Wasser und Speichel eingesetzt. Die Reaktionen wurden durch EvaGreen, einem DNA-interkalierenden Fluoreszenzfarbstoff, im Fluorometer mitverfolgt. Dabei wurde in der RPA ein Detektionslimit von 10^2-10^3 und in der PCR 10^4-10^6 DNA-Kopien/µl beobachtet. Da die RPA durch Magnesium-Ionen initiiert wird, wurden unterschiedliche Magnesiumkonzentrationen eingesetzt. Die Reaktion funktionierte bei 1,4mM Magnesiumchlorid, jedoch bei 0,14mM nicht. Weil die RPA bereits nach wenigen Minuten Ergebnisse liefern kann und bei einer konstanten Temperatur von 37°C amplifiziert, trägt sie großes Potential für schnelle und mobile Detektionssysteme.

Zusammenfassung (Englisch)

First experiments for detection of gene sequences in human saliva with Point of Care-application were done. DNA and Protein concentrations of whole saliva were studied. Afterwards the amplification of the DNA-sequence of interest was observed. Ethanol precipitation and RNase digestion were used to clean up DNA from saliva. The absorbance of the pure DNA-samples were measured at 260/280nm in the spectrometer. The average DNA concentration was 3914,5 ng/100µl saliva with a standard deviation of +/- 2362,6. The average absorbance of saliva samples, that were measured in the bicinchoninic acid (BCA) assay, was 3,5. Because bovine serum albumin isn’t sufficient to determine the real protein concentration of saliva, dilution series of abundant saliva proteins(mucines, α-amylase, albumin, immunglobulin A, cystatin S and lysozyme C) were also measured in the BCA-assay. Clear differences in absorbance of these proteins could be shown. Focus of this work was the comparison of Polymerase Chain Reaction(PCR) and Recombinase Polymerase Amplification(RPA). Therefor dilution series of synthetic antibiotic-resistance-carrying gene sequences of Staphylococcus Aureus, mecA and vanA, were made in water and saliva. EvaGreen, a DNA-intercalating fluorescence dye, was used to read the reaction in the fluorometer. In the RPA a limits of detection of 10^2-10^3 and in the PCR 10^4-10^6 DNA-copies/µl were observed. Because the reaction of RPA is initiated by magnesium, different concentrations of magnesium were tested. The reaction works at 1,4mM magnesiumchlorid, but at 0,14mM not. Since RPA brings out results in a few minutes and works at a constant temperature of 37°C, it keeps huge capability for fast and mobile detection systems.