Titelaufnahme

Titel
Prozessentwicklung einer Fermentation zur rekombinanten Herstellung von scFv mittels E.coli : Tangential Fluss Filtration - Ultra-/Diafiltration
Weitere Titel
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VerfasserAichinger, Frances-Dee
GutachterBliem, Rudolf Friedrich ; Maurer, Michael
Erschienen2015
Datum der AbgabeJuni 2015
SpracheDeutsch
DokumenttypBachelorarbeit
Schlagwörter (DE)scFv / E.coli / Ultrafiltration / Diafiltration
Zugriffsbeschränkung
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Klassifikation
Zusammenfassung (Deutsch)

Im Rahmen der Bachelorarbeit wurde eine Anlage zur Herstellung von human scFv durch Fermentation von rekombinantem E. coli konzipiert, ausgelegt und spezifiziert. Teilbereiche dieses Projektes wurden von einzelnen Projektmitgliedern in Form von diversen erstellten Dokumenten beigetragen. Im Speziellen behandelt diese Arbeit den Teilschritt der Ultra-/Diafiltration in der Phase des Downstream der Produktion.

Zunächst wurde ein R&I Schema der Anlage zu diesem Teilprozess erstellt aus welchem sowohl die benötigten Gerätschaften als auch der Medienfluss ersichtlich sind. Das gewählte System besteht im Wesentlichen aus zwei Hollow Fiber Filtrationsmodulen, einer 4-Kolben-Membranpumpe und einem Durchflusssensor. Zu diesen Gerätschaften wurden je ein Lastenheft, ein Pflichtenheft sowie eine Spezifikation erstellt. Die ausgewählten Hollow Fiber Filtrationsmodule von Sprectrum Labs Inc. bestehen aus mPES Hohlfasern (modified Polyethersulfone) mit einem Durchmesser von 0,5 mm und einem MWCO (Molecular Weigh Cut-Off) von 5 kD. Bei zwei Modulen ergibt dies eine Gesamtfilterfläche von 8,2 m². Die 4-Kolbenmembranpumpe der Marke Quattroflow™ von Almatec Maschinenbau GmbH hat eine maximale Förderleistung von 5000 L/h. Dieses System wurde auf Grund einer höheren Durchflussrate und einer somit verkürzten Prozesszeit, verglichen mit Filtrationskasetten, gewählt. Die Wahl eines Durchflusssensors fiel auf Leviflow® von Levitronix, da dieser zum einen nicht produktberührt und zum anderen unkompliziert zu installieren ist.

Ebenso wurde im Rahmen des Projektes eine SOP (Standard Operating Procedure) betreffend den Ablauf der Ultra-/Diafiltration erstellt. Die aus der Homogenisation resultierende Zellsuspension (420 Liter) wird zunächst mit Hilfe eines Filters (Porengröße 0,45 µm) von gröberen Zellbestandteilen befreit. Danach gelangt die Suspension zur Ultra-/Diafiltration mit deren Hilfe eine Aufkonzentrierung sowie ein Pufferaustausch stattfinden. Der erste Abschnitt dieses Teilprozesses beinhaltet die Ultrafiltration in der das Produkt (25 kD) um einen Faktor 5 aufkonzentriert wird. Im zweiten Abschnitt findet eine Diafiltration mit einem 6-fachen Volumswechsel statt, um eine Auswaschung des Nährmediums sowie kleinerer Zellbestandteile zu gewährleisten. Hierbei wird die Produktmatrix gegen einen Puffer (20mM Natriumphosphat, 500 mM NaCl und 20 mM Imidazol) ausgetauscht. Während des Filtrationsprozesses ist ein zu hoher Transmembrandruck (> 500 mbar) mit steigender Viskosität bei fortschreitender Aufkonzentrierung zu vermeiden. Nach dem Filtrationsprozess wird das Retentat über Filterkapsulen (Porengröße 0,2 µm) in Single-Use Bags gesammelt und bis zur weiteren Aufbereitung in der Chromatographie bei 5°C ± 3°C gelagert. Die Produktkonzentration des Retentats sollte bei 50 mg/L bei einem Endvolumen von 84 Litern liegen.

Die Dokumentation zum Ablauf des Prozess wurde in Form eines MBRs (Master Batch Record) erstellt. Dieses Dokument fasst die einzelnen Arbeitsschritte der SOP zusammen, die in einer bestimmten Reihenfolge abgearbeitet und mit einem Signum versehen werden müssen. Der MBR beinhaltet die Vorbereitung der Equipments, die Durchführung des Prozesses, die Probenahme und die Zwischenlagerung des Produktes bis zur weiteres Aufbereitung in der Chromatographie.

Abschließend wurde eine zusätzliche SOP in englischer Sprache verfasst, die die Bestimmung der Host-DNA als In-Prozess Kontrolle beinhaltet. Als Methode wurde hier eine PCR (Polymerase Chain Reaction) gefolgt von einer Affinity-Based Collection gewählt. Die Bestimmung der DNA erfolgt photometrisch in einem Mikrotiterplatten-Photometer bei einer Wellenlänge von 405 nm.

Zusammenfassung (Englisch)

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