Titelaufnahme

Titel
Etablierung einer PNA-Clamp PCR für KRAS-Exon 2 und 3 sowie für NRAS Exon 3 Mutationen
Weitere Titel
Establishment of a PNA -Clamp PCR for KRAS exon 2 and 3 and for NRAS exon 3 mutations
VerfasserJäger, Iris Maria
Betreuer / BetreuerinSeper, Helena
Erschienen2015
Datum der AbgabeJuni 2015
SpracheDeutsch
DokumenttypBachelorarbeit
Schlagwörter (DE)mCRC / KRAS-Mutationen / NRAS-Mutationen / PNA-Clamping / Sanger-Sequenzierung / Mutationsanalyse
Schlagwörter (EN)mCRC / KRAS-mutations / NRAS-mutations / PNA-clamping / Sanger-sequnecing / mutation analysis
Zugriffsbeschränkung
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Klassifikation
Zusammenfassung (Deutsch)

Die Anti-EGFR-Therapie stellt ein wertvolles Tool in der molekularbiologischen Therapie des metastasierenden kolorektalen Karzinoms dar. RAS-Mutationen werden als klinisch validierte Biomarker bezüglich einer Anti-EGFR-Therapie angesehen. Dabei zeigt sich, dass KRAS- und NRAS-Mutationen negativ prädiktiv für das Ansprechen auf diese Form der Therapie sind, da Patienten mit RAS-mutierten Tumoren, keinen oder nur einen marginalen Benefit durch eine Anti-EGFR-Therapie erfahren. Daher muss vor Therapiebeginn der RAS-Mutationsstatus des Tumors ermittelt werden. Nach wie vor ist die Sanger-Sequenzierung die Gold-Standard Methode zur Mutationsanalyse des RAS-Status. Eine weitere, weitaus sensitivere Analysemethode zur Identifikation von Alterationen stellt die PNA-Clamp PCR dar. In den erhältlichen Kits, z.B. der Fa. Panagene, werden die mittels PNA-Clamp PCR amplifizierten Produkte jedoch nicht der Sanger-Sequenzierung zugeführt, sondern über Streifenhybridisierungs- oder Chiphybridisierungs-Methoden ausgewertet. Im Zuge dieser Bachelorarbeit soll nun eine PNA-Clamp PCR zum KRAS- und NRAS- Mutationsnachweis in den Exons 2 und 3 etabliert werden. Analysiert wurde Tumor-DNA aus sieben archivierten Formalin fixierten in Paraffin eingebetteten Fällen von metastasierenden kolorektalen Karzinomen. Dabei wurden die optimalen Clamp Konzentrationen anhand von geometrischen Verdünnungsreihen, welche unterschiedliche Mutationsanteile aufweisen, ermittelt. Die aus dieser Reaktion erhaltenen PCR-Amplifikate wurden anschließend der Sanger-Sequenzierung zugeführt. In weiterer Folge wurden die Ergebnisse der Clamping-Methode und der konventionellen Sanger-Sequenzierung gegenübergestellt und miteinander verglichen. Dabei konnte für KRAS Exon 2 mit einem bereits publizierten PNA-Oligonukleotid eine PNA-Clamp PCR für die anschließende Sanger-Sequenzierung etabliert werden. Für KRAS Exon 3 und NRAS Exon 3 konnten funktionierende Clamps designed und deren Funktionalität demonstriert werden.

Zusammenfassung (Englisch)

Anti-EGFR-therapy is a successful tool for molecular biologic therapy of the metastatic colorectal carcinoma. RAS-mutation represents a biomarker with proven clinical validity in relation to anti-EGFR-therapy. Previous studies have shown that KRAS and NRAS mutation is a negative predictor off response to this form of therapy, because patients with RAS-mutated tumors have no or only marginal benefit of anti-EGFR-therapy. Therefore, it is necessary to determine the RAS-mutation status before starting the therapy. Sanger-sequencing is still the gold standard method used for analysis of the RAS mutation-status. A more sensitive method to identify alterations is the utilization of PNA-Clamp PCR. However, in commercially available kits, e.g. from Panagene, the PNA-Clamp PCR amplified products are not analyzed by Sanger-sequencing. Instead, PCR products are investigated by strip-hybridization or chip-hybridization-methods. The aim of this thesis is to establish a detection method for KRAS and NRAS mutations in exons 2 and 3 based on PNA-Clamp PCR and Sanger-sequencing. Tumour-DNA of seven formalin fixed paraffin embedded specimen from metastatic colorectal carcinoma was used. The ideal clamp concentration was investigated based on serial dilution of mutated DNA. PCR products were subsequently analyzed by Sanger-sequencing. Results were evaluated by comparing the clamping method to conventional Sanger-sequencing. With a previously published PNA oligonucleotide, a PNA-Clamp PCR was established successfully for KRAS exon 2. For KRAS exon 3 and NRAS exon 3 clamps were designed and demonstrated to be functional in PCR reactions.