Titelaufnahme

Titel
Charakterisierung der Expression von CD4 und der Interferon-γ Produktion in porzinen T-Zellen durch simultanen Nachweis von messenger RNA und Protein
Weitere Titel
Characterization of the expression of CD4 and interferon-γ production in porcine T-cells by simultaneous detection of messenger RNA and protein
VerfasserLück, Jennifer
Betreuer / BetreuerinMacho, Michaela
Erschienen2015
Datum der AbgabeJuni 2015
SpracheDeutsch
DokumenttypBachelorarbeit
Schlagwörter (DE)Genexpression / Protein / RNA / Prime FlowRNA™ Assay / CD4 / Interferon-γ
Schlagwörter (EN)gene expression / protein / RNA / Prime FlowRNA™ Assay / CD4 / Interferon-γ
Zugriffsbeschränkung
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Klassifikation
Zusammenfassung (Deutsch)

Von der Firma Affymetrix wurde ein neues Assay für den simultanen Nachweis von messenger Ribonukleinsäure (mRNA) und ihres korrespondierenden Proteins entwickelt. Die Technik des Prime RNAFlow™ Assays basiert auf der Markierung der Proteine mittels fluoreszenzmarkierter Antikörper, sowie der Markierung der mRNA Moleküle durch Hybridisierung mit fluoreszenzmarkierten Sonden. Zuerst werden die Oberflächenmarker angefärbt, nach der Fixierung und Permeabilisierung können auch intrazelluläre Proteine der Zellen markiert werden. Anschließend folgt ein mehrstufiges Hybridisierungsprotokoll mit genspezifischen Sonden, Pre-Amplifiern, Amplifiern und den fluoreszenzmarkierten Sonden. Bei diesem Assay gibt es drei Markierungstypen, Typ 1, Typ 4 und Typ 6 die angeblich auch in einem Multiplexverfahren eingesetzt werden können. Jede dieser Markierungen besteht aus unterschiedlichen Pre-Amplifiern, Amplifiern und fluoreszenzmarkierten Sonden. Bei der Typ 1 Markierung wird der Fluoreszenzfarbstoff Alexa Fluor 647 für den Nachweis von niedrigen und unbekannten Expressionslevels angewendet. Auf der anderen Seite gibt es für den Nachweis von mittleren bis hohen Expressionslevels noch die Typ 4 Markierung mit Alexa Fluor 488 und die Typ 6 Markierung mit Alexa Fluor 750. Ich habe in meiner Arbeit die allgemeine Funktionalität des Assays und die drei verschiedenen Markierungstypen anhand der Expressionsanalyse von Aktin-β, CD4 und Interferon-γ bei unterschiedlich stimulierten Zellen ausgetestet. Meine Ergebnisse zeigen, dass der simultane Nachweis von mRNA und Proteinen möglich ist, wobei er gewissen Limitationen unterworfen ist. So lieferte nur die Typ 1 Markierung plausible Ergebnisse, da sowohl bei der Typ 4 als auch bei der Typ 6 Markierung kaum Signale gemessen werden konnten. Des Weiteren zeigt sich, dass eine mögliche Kreuzreaktivität zwischen den Markierungstypen vorhanden sein könnte.

Zusammenfassung (Englisch)

Affymetrix Inc. developed a novel assay for the simultaneous detection of mRNA and its corresponding proteins. The technique of the Prime RNAFlow™ assay is based on the labeling of proteins by fluorescent antibodies, as well as the detection of mRNA molecules by hybridization with fluorescence labeled probes. First, surface staining is done, after the fixation and permeabilization of the cells intracellular proteins can be labeled. This is followed by a multi-stage hybridization protocol with gene-specific probes, pre-amplifiers, amplifiers and fluorescence labeled probes. In this assay, there are three types of labels, type 1, type 4 and type 6, which can supposedly be used in a multiplex method. Each of these labels consists of different pre-amplifiers, amplifiers and fluorescence labeled probes. The type 1 label with the fluorescent dye Alexa Fluor 647 is applied for the detection of low and unknown expression levels. On the other hand, for the detection of medium to high levels of expression the type 4 labeling with Alexa Fluor 488 and the type 6 labeling with Alexa Fluor 750 can be used. In my work I have tested the general functionality of the assay and the three different labels by expression analysis of actin-β, CD4 and interferon-γ in differentially stimulated cells. My results show that the simultaneous detection of mRNA and proteins is possible, but is subject to certain limitations. Only the type 1 label provided plausible results, since with both the type 4 as well as the type 6 label hardly any signals could be measured. Furthermore, it appears that a possible cross-reactivity between the types of labels could be present.