Titelaufnahme

Titel
In Vitro Untersuchung der Rolle von Hsp110 bei der Auflösung von Proteinaggregaten
Weitere Titel
In Vitro Assessment on the Role of Hsp110 in Protein Disaggregation
VerfasserGasser, Fabian
Erschienen2016
Datum der AbgabeSeptember 2016
SpracheEnglisch
DokumenttypBachelorarbeit
Schlagwörter (DE)Chaperone / Disaggregation / Hsp70-System / Hsp110 / Hefe
Schlagwörter (EN)Chaperones / Disaggregation / Hsp70 system / Hsp110 / Yeast
Zugriffsbeschränkung
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Klassifikation
Zusammenfassung (Deutsch)

Proteine spielen eine zentrale Rolle in nahezu allen biochemischen Prozessen, wobei ihre dreidimensionale Struktur für die spezifische Funktion in der Zelle ausschlaggebend ist. Umweltbedingter Stress, genetische Defekte und Zellalterung können zur Missfaltung und Aggregation von Proteinen führen. Die Stabilität und Funktionalität des Proteoms muss daher durch ein komplexes Netzwerk von Chaperonen gewährleistet werden, die die Denaturierung von Proteinen verhindern und ihre Faltung erleichtern. Hsp104 ist ein Chaperon in Saccharomyces cerevisiae, welches die in Aggregaten verwickelten Proteine extrahiert und sie für das Hsp70-System zugänglich macht. Hsp70 katalysiert die Rückfaltung fehlgefalteter Proteine durch ATP-abhängige Zyklen aus Substratbindung und -dissoziation, welche durch Nukleotid-Austauschfaktoren (nucleotide exchange factors, NEFs) gesteuert werden. Sse1, ein Mitglied der Hsp110-Familie, ist bekannt für seine Holdase- und NEF-Aktivität, allerdings ist seine Rolle in der Disaggregation von Proteinen im Zusammenspiel mit Hsp104 noch ungeklärt.

Die Rolle von Hsp110/Sse1 in Hsp104-vermittelter Disaggregation wurde in einem in-vitro-Ansatz untersucht, indem die Reaktivierung von Urea-denaturierter Firefly-Luciferase in stark Sse1-abgereicherten Hefelysaten gemessen wurde. In weiterer Folge wurde aufgereinigtes Sse1 in verschiedenen Konzentration zu den Lysaten hinzugefügt. Erstaunlicherweise erwies sich die Rückfaltung in Sse1-abgereicherten Lysaten effizienter als im Wildtyp, was auf die Hochregulation von anderen Hitzeschockproteinen zurückgeführt werden konnte. Die Zugabe von Sse1 führte zu einer signifikanten, dosisabhängigen Steigerung der Faltungsaktivität in Sse1-abgereicherten Lysaten. Die höchste Faltungseffizienz wurde bei 0.2 µM Sse1 festgestellt, während Konzentrationen über 1 µM die Reaktivierung zunehmend inhibierten. Interessanterweise wiesen Wildtyp-Lysate eine Sse1-Konzentration von 1.4 µM auf, was darauf hindeutet, dass Zellen eine geringfügig verminderte Faltungskapazität zugunsten einer deutlich erhöhten Holdase-Aktivität in Kauf nehmen. Dies führt zu der Hypothese, dass die primäre Aufgabe von Sse1 nicht die Rückfaltung von denaturierten Proteinen, sondern vielmehr die Prävention von Missfaltung und Aggregation ist.

Zusammenfassung (Englisch)

Proteins play a pivotal role in almost every biochemical process and the three-dimensional structure of a protein specifies its distinct cellular function. Environmental stress, genetic aberrations and ageing can cause misfolding and aggregation of proteins. The stability and functionality of the proteome must therefore be ensured by a complex network of chaperones, which prevent protein denaturation and facilitate refolding. Hsp104 is a chaperone in Saccharomyces cerevisiae that extracts entangled proteins from aggregates and makes them accessible to the Hsp70 system. Hsp70 catalyses refolding by ATP-dependent cycles of substrate binding and release that is regulated by nucleotide exchange factors (NEFs). Sse1, a member of the Hsp110-family, is known to provide NEF and also holdase activity, but its role in protein disaggregation in concert with Hsp104 remains unclear.

In an in vitro approach, the role of Hsp110/Sse1 in Hsp104-mediated disaggregation was assessed by monitoring the reactivation of urea-denatured firefly luciferase in Sse1-depleted yeast lysates. The lysates were then supplemented with different concentrations of purified Sse1. Surprisingly, refolding was more efficient in Sse1-depleted lysates than in wildtype, which probably correlated with the upregulation of other heat-shock proteins. Addition of Sse1 significantly enhanced the refolding activity in a concentration-dependent manner in Sse1-depleted lysates. Optimal recovery was achieved at 0.2 µM Sse1, while concentrations above 1 µM progressively inhibited refolding. Interestingly, wildtype lysates were found to harbour 1.4 µM Sse1, indicating that cells might sustain a minor loss of refolding capacity in return for extensively enhanced holdase activity. This leads to the hypothesis that the primary role of Sse1 is prevention of misfolding and aggregation rather than recovery of denatured protein.