Titelaufnahme

Titel
In vitro 3D Spheroid Kulturen primärer humaner Hepatozyten als verbessertes Mittel zum Screening auf Cytochrom P450 Induktion und Hepatotoxizität
Weitere Titel
In Vitro 3D Spheroid Cultures of Primary Human Hepatocytes as Improved Tool for Screening of Cytochrome P450 Induction and Drug-Induced Liver Toxicity
AutorInnenKamper, Elisabeth
Erschienen2016
Datum der AbgabeJuli 2016
SpracheEnglisch
DokumenttypBachelorarbeit
Schlagwörter (DE)3D Kulturen primärer humaner Hepatozyten / in vitro Screening / Cytochrom P450 / Epidermaler Growth Factor Rezeptor / arzneimittelbedingte Hepatotoxizität
Schlagwörter (EN)3D cultures of primary human hepatocytes / in vitro screening / cytochrome P450 / epidermal growth factor receptor / drug-induced liver toxicity
Zugriffsbeschränkung
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Klassifikation
Zusammenfassung (Deutsch)

Ziel der folgenden Versuche war es, die Leistungsfähigkeit eines neu entwickelten 3D in vitro Modells der Leber namens Spheroid im Hinblick auf das Screening von Cytochrom P450 (CYP450) Induktion und Hepatotoxizität von Arzneimitteln zu untersuchen. Im Zentrum der Versuche zur CYP450 Induktion stand die Identifizierung des Induktionsmechanismus von Wirkstoff A. Es ist bekannt, dass nukleäre Rezeptoren wie der Constitutive Androstane Rezeptor (CAR) in CYP450 Induktion involviert sind, und vorherige Versuche mit Wirkstoff A haben darauf hingedeutet, dass Epidermal Growth Factor Rezeptors (EGFR) Signalwege mit einem von Wirkstoff A beeinflussten downstream-Protein interagieren könnten. Daher wurden Wirkstoff A und klassische Induktoren alleine oder in Kombination mit dem CAR-Inhibitor Metformin sowie Inhibitoren verschiedener EGFR-Signalwegkomponenten getestet. Anschließend wurden die CYP450 mRNA Levels mittels qPCR analysiert. Weiters wurde der Einfluss von Wirkstoff A und klassischen Induktoren auf die Phosphorylierung des EGFR mittels Western Blot untersucht. Um die Leistungsfähigkeit von Spheroidkulturen primärer humaner Hepatozyten (PHH) als Mittel zum Screening der Hepatotoxizität von Arzneimitteln zu analysieren, wurden Wirkstoffe getestet, die zuvor in 2D-Kulturen falsch klassifiziert worden waren, und die Zellviabilität wurde mittels ATP-Assay bestimmt. Der Mechanismus der CYP450 Induktion durch Wirkstoff A konnte noch nicht identifiziert werden, jedoch sind EGFR-Signalwege anscheinend nicht beteiligt. Andererseits scheinen EGFR-Signalwege sehr wohl in die Inhibierung von CYP450 Induktion und Expression via EGF beteiligt. Da einige Versuche widersprüchliche Ergebnisse lieferten, sind weitere Untersuchungen nötig um die die Verlässlichkeit des Spheroidmodells im Hinblick auf das Screening von CYP450 Induktion zu prüfen. Allerdings scheint das Modell sehr stabil zu sein, weshalb es wahrscheinlicher ist, dass ein noch nicht identifiziertes Problem die Ursache für die Inkonsistenzen ist. Für das Screening auf Hepatotoxizität von Arzneimitteln scheint der Einsatz des Spheroidmodells jedenfalls vielversprechend. Durch eine Anwendung von Spheroiden zusätzlich zu 2D-Kulturen könnten die Ergebnisse der Screenings verbessert werden.

Zusammenfassung (Englisch)

The objective of the following project was to assess the performance of a newly established 3D in vitro model of the liver called “spheroid” as a tool for the screening of cytochrome P450 (CYP450) induction and drug-induced liver toxicity. With regard to the screening of CYP450 induction, the identification of the mechanism underlying induction by compound A was at the centre of interest. It is known that nuclear receptors such as the constitutive androstane receptor (CAR) are involved in CYP450 induction, and preliminary experiments with compound A have suggested that epidermal growth factor receptor (EGFR) signalling interferes with a downstream protein affected by compound A. Thus, compound A or classical CYP450 inducers were tested alone or in combination with the CAR inhibitor metformin as well as different EGFR-pathway inhibitors. Thereafter, changes in CYP450 mRNA levels were analysed by qPCR. Also, changes in EGFR-phosphorylation upon treatment with compound A or classical CYP450 inducers were analysed by Western blot. To investigate the performance of spheroid cultures of primary human hepatocytes (PHH) in the screening of drug-induced liver toxicity, compounds that had previously been incorrectly classified in 2D cultures of PHH were tested in the spheroid model, and cell viability was assessed by ATP assay. In conclusion, the mechanism of CYP450 induction by compound A could not yet be identified, although the EGFR pathway does not seem to be involved. However, the EGFR pathway seems to be involved in the suppression of CYP450 induction and expression via EGF. Since some experiments yielded inconsistent results, the reliability of the spheroid model in the screening of CYP450 induction should be further investigated, but the model seems to be stable and it is more likely that a yet unidentified problem caused this inconsistency. With respect to the screening of drug-induced liver toxicity, the spheroid model seems to be a promising tool that can be used in addition to screenings in 2D cultures to improve results.

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