Titelaufnahme

Titel
CRISPRi-vermittelte Herabregulierung von EGFL7 während der Blutgefäßentwicklung von humanen embryonalen Stammzellen
Weitere Titel
CRISPRi-Mediated Downregulation of EGFL7 During Human Embryonic Stem Cell Vascular Development
VerfasserOberbauer, Vera
Erschienen2016
Datum der AbgabeSeptember 2016
SpracheEnglisch
DokumenttypBachelorarbeit
Schlagwörter (DE)CRISPRi / Menschliche embryonale Stammzellen / Blutgefäßentwicklung / EGFL7 / Embryonale Entwicklung
Schlagwörter (EN)CRISPRi / human embryonic stem cells / blood vessel development / EGFL7 / embryonic development
Zugriffsbeschränkung
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Klassifikation
Zusammenfassung (Deutsch)

Die Bildung neuer Blutgefäße ist von hohem Stellenwert sowohl in der embryonalen Entwicklung als auch im adulten Organismus. Daher ist die Entwicklung des Endothels in der frühen Entwicklung entscheidend um das vaskuläre Netzwerk während der Vaskulogenese zu formen und später während der Angiogenese umzubilden. Epidermal growth factor-like domain 7 (EGFL7), ein sekretiertes Protein der extrazellulären Matrix, scheint zu einer idealen Umgebung für die Blutgefäßentwicklung beizutragen und die Abwesenheit dieses Proteins hat verheerende Auswirkungen auf die Bildung der Blutgefäße. Das clustered regulatory interspaced short palindromic repeats (CRISPR) System wurde in Bakterien gefunden und dient dort zur Immunantwort. In den vergangenen Jahren wurde es weitläufig erforscht und entwickelt. Als ein Resultat dessen wurde das CRISPR interference (CRISPRi) System generiert, das die Transkription von Targetgenen durch Blockierung der Elongation beeinflussen kann. Das Ziel dieses Projektes war es das CRISPRi System in humanen embryonalen Stammzellen (hESCs) mittels lentiviraler Infektion zu etablieren und die drei Transkripte des egfl7 nach den ersten drei Tagen der mesodermalen Differenzierung herabzuregulieren. Single guide RNAs (sgRNAs) wurden hierfür nach der Infektion in die hESCs transfektiert und führen das System zur korrekten Stelle im Genom. Dieser Ansatz würde es möglich machen den Einfluss von EGFL7 auf Vaskulogenese während der frühen embryonalen Entwicklung zu untersuchen. In diesem Projekt ist es uns gelungen den Schritt der Transfektion von hESCs mit sgRNAs zu erreichen. Unsere Ergebnisse lassen vermuten, dass die verwendeten Methoden zur Infektion, Selektion und Transfektion zu aggressiv sind und trotz Optimierung weiter adaptiert werden müssen.

Zusammenfassung (Englisch)

The formation of new blood vessels is of high importance in embryonic development as well as in the adult organism. Endothelial development therefore is crucial in early development to form the vascular network during vasculogenesis that later can be remodeled in the process of angiogenesis epidermal growth factor-like domain 7 (EGFL7), a secreted protein of the extracellular matrix (ECM), was found to be contributing to an ideal environment for blood vessels to develop and the absence of this protein has severe influence on the forming blood vessels. The clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) system was first found in bacteria and is there used for immune response. It has been broadly investigated and developed in the last years. As a result the CRISPR interference (CRISPRi) system was generated which can influence the transcription of targeted genes by blocking the elongation. The aim of this project was to establish a CRISPRi system in human embryonic stem cells (hESCs) by lentiviral infection and knocking down the three present transcripts of egfl7 after three days of mesodermal differentiation. Single guide RNAs (sgRNAs) were therefore after infection transfected into the hESCs and are leading the system to the correct sites on the genome. This approach would make it possible to investigate the influence of EGFL7 on vasculogenesis in early embryonic development. In this project we were able to reach the step of transfection hESCs with sgRNAs. Our results suggest that the methods used for infection, selection and transfection are too aggressive and, even though optimization was done, need to be further adapted for the cause.