Titelaufnahme

Titel
Der Einfluss von Oligosaccharyltransferase (OST) auf die N-Glykosylierung von Proteinen in Nicotiana benthamiana
Weitere Titel
The Impact of Oligosaccharyltransferase (OST) on Protein N-Glycosylation in Nicotiana benthamiana
AutorInnenPfeiffer, Christina
Erschienen2016
Datum der AbgabeJuli 2016
SpracheEnglisch
DokumenttypBachelorarbeit
Schlagwörter (DE)Oligosaccharyltransferase / OST / LmSST3D / SST3 / N-Glykosylierung / Nicotiana benthamiana / Transiente Expression
Schlagwörter (EN)Oligosaccharyltransferase / OST / LmSST3D / SST3 / N-glycosylation / Nicotiana benthamiana / Transient expression
Zugriffsbeschränkung
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Klassifikation
Zusammenfassung (Deutsch)

Nicotiana benthamiana dient als attraktive Expressionsplattform um therapeutisch relevante, rekombinante Proteine im großen Maßstab herzustellen. Pflanzen ermöglichen post-translationale Modifikationen, wie zum Beispiel Glyklosylierung, welche auch in menschlichen Zellen zu finden sind. Um Glykoproteine effizient zu exprimieren wird oftmals Agroinfiltration basierend auf viralen Vektoren angewandt. Eine Herausforderung stellt hierbei der Anteil an unglykosylierten Protein dar, welcher bei der transienten Expression in N. benthamiana beobachtet werden kann. Im ersten Schritt der N-Glykosylierung erfolgt der Transfer eines Oligosaccharid-Vorläufers auf ein Asparagin der formenden Polypeptidkette durch das Enzym Oligosaccharyltransferase (OST). In dieser Arbeit analysierten wir den Einfluss der Untereinheit STT3D von Leishmaniana major (LmSTT3D) auf die Effizienz der N-Glykosylierung von unterschiedlichen humanen Glykoproteinen, welche transient exprimiert wurden - sowohl mit als auch ohne LmSTT3D. Analysiert wurden die Proteine biochemisch an Hand von Gelelektrophorese, Immunblots und einer präzisen Analyse der N-Glykane basierend auf der Massenspektrometrie. Die Ergebnisse zeigten einen signifikanten Anstieg der N-Glykosylierung bei Zugabe von LmSTT3D, jedoch kann die Methode nicht für alle Proteine verallgemeinert werden. Eine weitere unerwartete Beobachtung war, dass bei Proteinen, welche aus der interstitiellen Flüssigkeit gewonnen wurden, die Proteinakkumulation bei Zugabe von LmSTT3D deutlich verringert war.

Zusammenfassung (Englisch)

Plants like Nicotiana benthamiana are an attractive expression platform to produce large amounts of recombinant proteins with therapeutic value. One advantage of plants is that they can perform post-translational modifications, such as glycosylation, similar to mammalian cells. An often used approach for the efficient expression of recombinant glycoproteins in plants is agroinfiltration based on viral vectors. A challenge for the production of glycoproteins in plants is the unglycosylated portions which are often observed upon transient expression in N. benthamiana. The initial step of the N-glycosylation pathway is the transfer of the oligosaccharide precursor to the asparagine of the nascent polypeptide chain by the enzyme oligosaccharyltransferase (OST). Here we analysed the impact from the Leishmaniana major STT3D (LmSTT3D) subunit of OST to the N-glycosylation efficiency on various human glycoproteins which were transiently expressed with and without LmSTT3D. Recombinant proteins were biochemically analysed including gel electrophoresis, immunoblotting and precise N-glycan analysis by mass spectrometric based analysis. The results exhibited a significantly increased occupancy of N-glycosylation when LmSTT3D was co-expressed for some proteins. However the results also showed that the method cannot be generalised for all proteins. Another unexpected observation was that recombinant proteins secreted to interstitial fluid (IF) showed a decreased protein accumulation after co-infiltration with LmSTT3D.

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