Titelaufnahme

Titel
Etablierung der isoelektrischen Fokussierung zur Analyse von Stress-assoziierten post-translationalen Proteinmodifikationen im Modell der PD
Weitere Titel
Establishment of isoelectric focusing to analyze stress-associated post-translational protein modifications in experimental peritoneal dialysis
VerfasserBromberger, Sophie
GutachterEnzinger, Sabine
Erschienen2016
Datum der AbgabeJuni 2016
SpracheDeutsch
DokumenttypBachelorarbeit
Schlagwörter (DE)Peritonealdialyse / Hitzeschock / Post-translationale Modifikationen / Phosphorylierung / Isoelektrische Fokussierung
Schlagwörter (EN)peritoneal dialysis / heat shock / post-translational modifications / phosphorylation / isoelectric focusing
Zugriffsbeschränkung
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Klassifikation
Zusammenfassung (Deutsch)

In der Peritonealdialyse stellt die Bioinkompatibilität der verwendeten Peritonealdialyseflüssigkeiten (PDF) ein großes Problem dar, welche bei akuter Exposition zu einer zytoprotektiven Stressantwort der peritonealen Mesothelzellen führt. Diese Stressantwort charakterisiert sich durch die gesteigerte Expression von Stress-assoziierten Proteinen (z.B. Hitzeschockproteinen) und einer Veränderung in der Rate von post-translationalen Modifikationen (PTM). Bei chronischer Exposition wurde jedoch eine Verminderung dieser Prozesse nachgewiesen, was einen verminderten Schutz der Mesothelzellen gegenüber diesem chemischen Stress bedeutet. Um diesen Sachverhalt genauer zu untersuchen, braucht es eine geeignete Methode, mit der man bestimmte Stress-assoziierte Proteine auf ihre PTM analysieren kann. Der Goldstandard, die 2D-Gelelektrophorese, ist zwar sehr sensitiv, aber auch zeitaufwendig und ermöglicht nur einen geringen Probendurchsatz. Die isoelektrische Fokussierung (IEF) mit anschließendem Western Blot ist hingegen ein sehr sensitives Verfahren, welches die minimalen Ladungsänderungen durch post-translationale Modifikationen mehrerer Proben gleichzeitig detektieren kann. Ziel war es daher diese Methode auf ihre Anwendbarkeit zur Analyse der Stress-assoziierten Veränderungen von post-translationalen Proteinmodifikationen zu überprüfen. Von zwei getesteten Systemen zeigte sich die horizontale IEF hinsichtlich Handhabung, Auftrennungsverhalten, Färbe- und Immundetektionsergebnisse überlegen. Das horizontale IEF-System von GE Healthcare in Kombination mit FocusGels der Firma Serva stellt einen vielversprechenden Ansatz zum Nachweis von Protein-Isoformen während unterschiedlicher Stressbedingungen dar. Für das Target-Protein Hsp27 konnten sichtbare Veränderungen der PTM-Muster bei Behandlung mit Hitze und/oder PDF detektiert werden. Für die Verwendung der IEF zum Erstellen und Validieren von spezifischen PTM-Profilen unterschiedlicher Stress-assoziierter Proteine muss diese Methode jedoch noch weiter optimiert werden.

Zusammenfassung (Englisch)

One main problem in current peritoneal dialysis is the bioincompatibility of the peritoneal dialysis fluids (PDF), which leads to a cytoprotective stress response in the peritoneal mesothelial cells during acute exposure. This stress response is characterized by the elevated expression of stress-associated proteins (e.g. heat shock proteins) and a changed rate of post-translational modifications (PTM). However in chronic peritoneal dialysis models a downregulation of these processes has been shown, which leads to a decreased protection of the cells. To further investigate these circumstances, a method to analyze certain stress-associated proteins with special attention on their post-translational modifications is needed. The gold standard in this field, 2D-electrophoresis, is a very sensitive method but lacks efficiency in duration and sample throughput. Isoelectric focusing (IEF) with a following western blot represents a highly sensitive technique, which can detect the minimal changes in charge of a protein due to PTM in several samples at a time. The goal of this thesis was to test this method in regard of its applicability to analyze the stress-associated changes of post-translational protein modifications. Of two tested systems, the horizontal IEF showed to be superior in matters of handling, quality of separation, staining and immunodetection results. The horizontal IEF System by GE Healthcare combined with Serva FocusGels represents a promising approach to detect protein isoforms during various stress stimuli. In the case of the target protein Hsp27 it was possible to detect visible changes in the pattern of PTM due to heat or PDF exposure. However, to apply the IEF for establishing and validating specific PTM profiles of different stress-associated proteins this method needs further optimization.