Titelaufnahme

Titel
Evaluierung von massive parallel sequencing (MPS) in der Detektion von KIT und PDGFRA Mutationen in Gastrointestinalen Stromatumoren (GIST)
Weitere Titel
Evaluation of massive parallel sequencing (MPS) in the detection of KIT and PDGFRA mutations in gastrointestinal stromal tumours (GIST)
VerfasserFischer, Marina
Betreuer / BetreuerinMitterer, Gerfried
Erschienen2016
Datum der AbgabeJuni 2016
SpracheDeutsch
DokumenttypBachelorarbeit
Schlagwörter (DE)Gastrointestinale Stromatumore / GIST / KIT / Massives Paralleles Sequenzieren / MPS / Next Generation Sequencing / NGS / PDGFRA / Rezeptor-Tyrosinkinase / Sanger Sequenzierung
Schlagwörter (EN)gastrointestinal stromal tumours / GIST / KIT / massive parallel sequencing / MPS / next generation sequencing / NGS / PDGFRA / receptor tyrosine kinase / Sanger sequencing
Zugriffsbeschränkung
 _
Klassifikation
Zusammenfassung (Deutsch)

Diese Arbeit beschäftigt sich mit der retrospektiven Evaluierung der Detektion von KIT und PDGFRA Mutationen in gastrointestinalen Stromatumoren (GIST) mittels „massive parallel sequencing“ (MPS), da der Einsatz von MPS-Plattformen in der klinischen Routinediagnostik dieser Tumore nicht zum Standard gehört. Die Therapie-relevanten Exons 9, 11, 13 und 17 von KIT sowie die Exons 12 und 18 von PDGFRA wurden anhand von 20 Proben mit MPS und der Goldstandardmethode nach Sanger sequenziert und miteinander verglichen, um folgende Fragestellungen zu beantworten:

• Welche signifikanten Unterschiede in Sensitivität und Spezifität bestehen bei der Detektion von Mutationen in GIST mittels MPS und Sanger Sequenzierung?

• Welche Differenzen in Bezug auf Kosten und Qualität gibt es zwischen diesen Untersuchungen?

Das Ziel der Bachelorarbeit ist die Evaluierung von MPS in der klinischen Diagnostik von GIST im pathologischen Institut des Kaiser-Franz-Josef Spitals. Das Stichprobenkollektiv umfasst 20 FFPE (formalin-fixed and paraffin-embedded)-Proben, welche bereits histologisch oder immunhistochemisch als GIST diagnostiziert und für die zum Diagnose-relevanten Zeitpunkt externe Mutationsanalysen durchgeführt wurden. Dazu wurde Tumor-DNA aus Paraffinblöcken isoliert und die relevanten Exons mittels Polymerasen-Ketten-Reaktion (PCR) amplifiziert. In der nachfolgenden Sequenzierreaktion wurde das PCR-Produkt mit Fluorochrom-markierten Dideoxy-Nukleotiden jeweils einzelsträngig amplifiziert, um vorhandene Variationen in der Basenabfolge mittels Kapillarelektrophorese am 3500 Dx Genetic Analyzer von Applied Biosystems detektieren zu können. Für die Durchführung der MPS-Analyse am MiSeq Sequencing System von Illumina wurden aliquote Anteile der DNA-Proben entsprechend einem Analyse-Vertrag mit Sophia Genetics an das Referenz-Labor von Multiplicom zur

Analyse versandt. Die Daten aus beiden Analyse-Verfahren der Proben des Pathologisch-Bakteriologischen Instituts, im Kaiser-Franz-Josef Spital, wurden statistisch mit Hilfe des McNemar Tests und Äquivalenzstudien ausgewertet und miteinander verglichen.

Die Ergebnisse der Sequenz-Analyse von insgesamt 120 Exons der Gene cKIT und PDGFRA, analysiert mit zwei Methoden, wurden einander gegenübergestellt. Davon waren mittels Sanger Sequenzierung 103 Exons als Wildtyp und 16 als mutiert

identifiziert worden. MPS detektierte 102 Wildtypen und 18 Mutationen. Unterschiede zeigen sich in der Analyse von drei Exons (RID 11 KIT Exon 11, RID 15 KIT Exon 11 und RID 3 PDGFRA Exon 18), die mit Sanger als Wildtyp erkannt wurden, mit MPS jedoch eine Mutation aufwiesen. Andererseits konnte im KIT Exon 11 von RID 3 mit Sanger eine Mutation detektiert werden, die mittels MPS als Wildtyp identifiziert wurde. Daraus ergibt sich für die Sanger Sequenzierung eine Sensitivität von 94% mit einem 95%igen Konfidenzintervall (CI) von 68% und 99% und eine Spezifität von 97% mit einem CI von 91% und 99%. MPS weist eine Sensitivität von 83% mit einem 95%-CI von 58% und 96%, sowie eine Spezifität von 99% mit einem CI von 94% und 99% auf. Da sich die Sensitivitäten und Spezifitäten ähneln, kann die Nullhypothese („es bestehen keine signifikanten Unterschiede in Sensitivität und Spezifität zwischen MPS und Sanger“) angenommen werden. Im Äquivalenztest beträgt die statistische Genauigkeit 96,6% mit einem 95%igen CI von 93,4% und 99,8%, weshalb die Alternativhypothese, welche besagt, dass Sanger und MPS in der Detektion von GIST gleichwertig sind, ebenfalls akzeptiert werden kann.

In der hier durchgeführten Analyse kann für MPS eine Kostenersparnis von 21,5% und eine geringere Anzahl an Arbeitsschritten erhoben werden. Dazu kommt, dass bei der Art des im Pathologisch-Bakteriologischen Instituts angewandten Analyse-Verfahrens, Kosten für eine Geräte-Investition entstehen, die Qualitätssicherung und Daten-Pflege jedoch als vernachlässigbar niedrig anfallen. Zusammenfassend erweist sich somit MPS als kostengünstiger, in Bezug auf eine größere Probenanzahl schneller und benötigt weniger DNA als die Sanger Sequenzierung. Der Goldstandard ist hingegen exakter sowie zuverlässiger. MPS kann in der Routinediagnostik von GIST grundsätzlich eingesetzt werden, die Nutzung bei einem seltenen Tumor wie GIST rentiert sich jedoch nicht, weshalb diese Proben weiterhin an ein Referenz-Labor zur MPS-Analyse versendet werden sollten.

Zusammenfassung (Englisch)

This thesis deals with the retrospective evaluation of massive parallel sequencing (MPS) in the detection of KIT and PDGFRA mutations in gastrointestinal stromal tumours (GIST), since the use of MPS platforms is not part of the standard routine diagnosis of these tumours. The relevant exons for therapy KIT 9, 11, 13 and 17 and PDGFRA 12 and 18 were sequenced with MPS and the gold standard method Sanger in 20 samples and compared to answer the following questions:

• Which significant differences in sensitivity and specificity by MPS and Sanger exist in the detection of mutations in GIST?

• What differences of cost and quality are there between those investigations?

The aim of this thesis is the evaluation of MPS in clinical diagnosis of GIST at the Pathological Institute of the Kaiser-Franz-Josef hospital. The sample includes 20 FFPE (formalin-fixed and paraffin-embedded) samples, which have already been histologically or immunohistochemically diagnosed as GIST. Therefore tumour DNA was isolated from paraffin blocks and the relevant exons were amplified through polymerase-chain-reaction (PCR). In the next step, the PCR product was labelled with fluorescent nucleotides to detect existing variations with capillary electrophoresis at 3500 Dx Genetic Analyzer from Applied Biosystems. For the accomplishment of the MPS analysis on the MiSeq Sequencing System from Illumina, aliquots of DNA samples were sent to the reference laboratory of Multiplicom, according to a contract with Sophia Genetics. The data from both methods were statistically evaluated and compared at the Pathological Institute of the Kaiser-Franz-Josef hospital, using McNemar test and equivalence studies.

In total, 120 exons of the genes cKIT and PDGFRA were analysed to compare these two methods. With Sanger 103 exons were wild type and 16 mutated. MPS detected 102 wild types and 18 mutations. Differences were found in three exons (RID 11 KIT exon 11, RID 15 KIT exon 11 and RID 3 PDGFRA exon 18) that have been identified with Sanger sequencing as wild type, but had a mutation with MPS. Vice versa, one exon was mutated with Sanger sequencing (RID 3 KIT exon 11), which MPS hasn’t detected. Therefore Sanger sequencing has a sensitivity of 94% with a 95% confidence interval (CI)

of 68% and 99% and a specificity of 97% with a CI of 91% and 99%. MPS has a sensitivity of 83% with a 95% CI of 58% and 96% and a specificity of 99% with a CI of 94% and 99%. Since the sensitivities and specificities are nearly similar, the null hypothesis (“there are no significant differences in sensitivity and specificity between MPS and Sanger sequencing”) can be accepted. In the equivalence test the statistical accuracy is 96.6% with a 95% CI of 93.4% and 99.8%, for which reason the alternative hypothesis (“Sanger sequencing and MPS are equivalent in the detection of GIST”) can also be accepted.

In this performed analysis cost savings of 21.5% and a smaller number of process steps can be evaluated for MPS. Moreover, there are costs of equipment investment for this type of method at the Pathologic Institute, but quality assurance and data maintenance occur negligible low. In summary, MPS is more cost-efficient, faster (referring to a greater number of samples) and requires less DNA than Sanger sequencing. However, the gold standard is more accurate and reliable. In principle MPS can be used in the routine diagnosis of GIST, but its use in a rare tumour like GIST is may not profitable. Therefore these samples should still be sent to a reference laboratory for MPS analysis.