Titelaufnahme

Titel
Struktur und Funktion des MacAB-TolC macrolide efflux Transport System aus Salmonella enterica ssp. enterica serovar Typhimurium strain SB905
Weitere Titel
Structure And Funktion Of The MacAB-TolC Macrolide Efflux Transport System Of Salmonella enterica ssp. enterica serovar Typhimurium Strain SB905
VerfasserSchachinger, Franziska
Erschienen2015
Datum der AbgabeJuli 2015
SpracheDeutsch
DokumenttypBachelorarbeit
Schlagwörter (DE)Salmonella enterica / Typ 1 Secretions System / Makrolid Drug Efflux Pumpe / sirA / ramA / marA / hilA / MacAB- TolC
Schlagwörter (EN)Salmonella enterica / type 1 secretion system / Macrolide drug efflux pump / sirA / ramA / marA / hilA / MacAB- TolC
Zugriffsbeschränkung
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Klassifikation
Zusammenfassung (Deutsch)

In Gram negativen Bakterien gibt es mehrere unterschiedliche Typen von Sekretionssystemen (Typ I – Typ VII). Zur Gruppe der Typ I Sekretionssysteme (T1SS) zählen unter anderem die bakteriellen Multi Drug Exporter AcrAB-TolC und MacAB-TolC1. Die hier vorliegende Arbeit befasst sich mit der Multi Drug Efflux Pumpe MacAB-TolC von Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium str. SB905. (in dieser Arbeit kurz geschrieben als Salmonella enterica SB905) Die Gene macA und macB des genannten Salmonella Strains wurden jeweils separat in pet52b(+) und pproEx Vektor kloniert. Die Konstrukte sind so erstellt worden, dass C-terminal bzw. N-terminal ein Histidin-Tag an die Proteine angehängt wird, sobald deren Expression in E.coli BL21(DE3) durch Isopropylthiogalaktosid (IPTG) induziert wird. Mittels Nickel-Affinitätschromatographie soll das überexprimierte MacA bzw. MacB gereinigt werden. Solbald die Proteine in reiner Form erhalten sind ist die Zielsetzung, sie zur Herstellung von Antiseren zu verwenden. Im Laufe der Experimente zeigte sich jedoch, dass mit den klonierten Konstrukten in dieser Form keine Überexpression erzielt werden kann. Die Antiserenproduktion ist im Ausmaß dieser Bachelorarbeit nicht behandelt worden.

Deletionsstämme von acrA bzw. acrB aus Salmonella enterica SB905 wurden erstellt, um aus diesen die Multi Drug Efflux Pumpe MacAB-TolC aufzureinigen. Nach Zugabe von Erythromycin zu einer Flüssigkultur dieser Stämme war zu erwarten, dass diese eine erhöhte Anzahl an MacAB-TolC Pumpen herstellen. Ob dies zutreffend ist wurde anhand isolierter RNA mittels Real Time Reverse Transcription quantitative Polymerease-kettenreaktion (RT RT qPCR) kontrolliert. Obwohl keine auffallende Mehr- Expression von MacAB-TolC Genen nachweisbar war, konnten in einer Präparation von Membran-proteinen im Elektronenmikroskop Pumpen gefunden werden, bei denen es sich möglicherweise um MacAB-TolC handelt.

In einem weiteren Versuch wurden Transkriptionsaktivatoren (hilA, marA, ramA, sirA) der Sekretionssysteme in Salmonella enterica SB905 kloniert. Diese sollen durch Arabinose induzierbar sein. Mittels RT RT qPCR sollte festgestellt werden, ob sich einerseits die Transkriptionsaktivatoren gegenseitig beeinflussen bzw. welche der Transkriptions-faktoren die T1SS- Pumpen AcrAB-TolC bzw. MacAB-TolC anschalten können.

Zusammenfassung (Englisch)

In Gram negative bacteria there are several types of secretion systems (type I – type VII) known. Among others, the bacterial multi drug exporter AcrAB-TolC and MacAB-TolC belong to the type 1 secretion system (T1SS). This Bachelor thesis is focused on the multi drug efflux pump MacAB-TolC secretion system in Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium str. SB905. (in this work written as the short version Salmonella enterica SB905) The genes macA and macB of this Salmonella strain have been cloned separately each one time in pet52b(+) and pproEx vector. The gene constructs were cloned in a way which leads to C- terminal or N- terminal histidine- tagged proteins, respectively, after induction with Isopropylthiogalaktosid (IPTG) in E.coli BL21(DE3). By the performance of nickle- affinity chromatography, the overexpressed MacA and MacB should have been purified. After a pure sample of each protein is received, the proteins should be used to produce antisera. The experiments have shown, that an overexpression of MacA and MacB protein was not achived with the cloned constructs. The production of antisera is not a part of this bachelor thesis.

Deletionstrains of acrA and acrB of Salmonella enterica SB905 have been prepared to purify the multi drug efflux pump MacAB-TolC. After erythromycin addition to a liquid cul-ture of the deletion strains, a higher amount of MacAB-TolC was expected. This assump-tion had to be proofed by RT RT qPCR from isolated RNA of the samples after erythromy-cin was added. Although no noticeable more- production of MacAB-TolC was detected, it was possible to find pumps in preperations of the deletionsstrains’ membraneproteins under the elektronmicroscope, those could possibly be MacAB-TolC.

In an additional experiment, activators of transcription (hilA, sirA, ramA, marA) of Salmonella enterica SB905 T1SS have been researched. The aim was to find out whether or how they influence each other and which one can activate the expression of MacAB-TolC or AcrAB-TolC.