Titelaufnahme

Titel
Untersuchung der Rolle der Autophagie und Apoptose in Prostata-Krebszellen in Antwort auf onkolytische Adenoviren, Phytochemikalien and Chemotherapie
Weitere Titel
Investigating the Role of Autophagy and Apoptosis in Prostate Cancer Cells in Response to Oncolytic Adenoviruses, Phytochemicals and Chemotherapeutics
AutorInnenMrschtik, Michaela
Erschienen2012
Datum der AbgabeJuli 2012
SpracheEnglisch
DokumenttypBachelorarbeit
Schlagwörter (DE)Prostatakrebs / Oncolytische Viren / Phytochemikalien / Autophagie / Apoptose
Schlagwörter (EN)prostate cancer / oncolytic virotherapy / phytochemicals / autophagy / apoptosis
Zugriffsbeschränkung
 _
Klassifikation
Zusammenfassung (Deutsch)

Kurzfassung

Diese Arbeit beschäftigt sich mit den Wirkungen das Phytochemikums Equol und dem Chemotherapeutikum Docetaxel in Kombination mit dem adenoviralen Deletionsmutanten Addeltadelta und dem zugehörigen Wildtyp-Virus in Androgen-Rezeptor positiven 22Rv1 und Androgen-insensitiven PC-3 Prostatakrebszellen. In diesem Projekt liegt der Fokus auf der Untersuchung von Makroautophagie (zukünftig der Einfachheit halber bezeichnet als Autophagie; zellulärer Prozess des „Selbst-essens“) und Apoptose (zellulärer Prozess des „Selbst-tötens“) ähnlichen Mechanismen. Die verwendeten Zelllinien wurden aufgrund ihrer Unterschiedlichkeit, die sowohl das Früh- als auch das Spätstadium von Prostatakrebs reflektieren, ausgewählt.

Frühere Untersuchungen zeigten, dass Addeltadelta mit Equol und Docetaxel kooperativen Zelltod auslösen kann, und dies wurde in diesem Project mehrfach durch Viability Assays verifiziert.

Des Weiteren wurde die Veränderung von Autophagie-Prozessen der einzelnen Wirkstoffe und der Wirkstoff-Virus Kombinationen untersucht. Adwt, Addeltadelta und Docetaxel, und zu geringerem Maß auch Equol, erhöhen das LC3B-II/I Verhältnis – ein Autophagie-Marker der direkt mit der Menge an Autophagosomen in den Zellen korreliert. LC3B-II kann sich ansammeln wenn Autophagie angeregt wird oder wenn der Prozess zu einem späten Zeitpunkt geblockt wird, daher wurden auch p62 Proteinlevels gemessen. p62 ist ein Adapterprotein, das autophagisches Kargo mit den entstehenden Autophagosomen verknüpft und dann bei der Fusion mit Lysosmen mit dem Kargo degradiert wird. Die Wirkstoffe allein zeigten hauptsächlich eine Akkumulation von p62 nach 48 h, was unterbrochenen autophagischen Fluss andeutet.

In Zellen, die mit synergisitsch interagierenden Virus-Wirkstoff Kombinationen behandelt wurden, stiegen LC3B-II Levels stark an und ein Abfall von p62 Levels im Vergleich zu den Einzelbehandlungen konnte beobachtet werden. Diese Beobachtung bestätigt dass Autophagie-Mechanismen in den synergistisch agierenden Kombinationen in spezifischer Art beeinflusst werden.

Es wurde gezeigt, dass der Mechanismus des erhöhten Zelltodes in den beiden verwendeten Zellinien wahrscheinlich unterschiedlich ist. In 22Rv1 Zellen konnte vermehrte Apoptose in den Kombinationstherapien verglichen zu den Einzelwirkstoffen beobachtet werden, während PC-3 Zellen diese Unterschiede nicht zeigten. Weitere Untersuchung von Zelltötungsmechanismen wie Necroptosis – eine regulierte Form von Nekrose – und der Einfluss der Bcl-2 Proteinfamilie auf das synergistische Zelltöten brachte keine eindeutigen Resultate und weitere, detailliertere Studien sind notwendig um die Natur des erhöhten Zelltodes in PC-3 Zellen zu bestimmen.

Zusätzlich wurde der Einfluss von Autophagie –modulierenden Wirkstoffen auf das Zellüberleben getestet. Die Induktion und der Block von Autophagie erhöht die Zelltötung durch Adwt oder Addeltadelta mit Equol stark in 22Rv1 Zellen und die Induktion von Autophagie zeigt ähnliche Muster in PC-3 Zellen. Dieser Effekt ist jedoch nicht in Virus und Docetaxel Kombinationen beobachtbar. Des Weiteren beeinflusst das erniedrigte Zellüberleben nicht die Levels von großem PARP Fragement, einem Marker für Apoptose, was andeutet, dass es durch Caspase-unabhängige Mechanismen zustande kommen könnte. Zusammen zeigen diese Ergebnisse, dass die Verönderung von Autophagie-Mechanismen durch Virus-Equol Kombinationen möglicherweise eine wichtige Rolle in der Zelltötung dieser Kombination haben, jedoch sind weitere Untersuchungen notwendig um die Verbindung dieser Prozesse im untersuchten Modell zu bestimmen.

Insgesamt zeigen die Resultate dass Autophagie-Prozesse durch die untersuchten Wirkstoffe und die Virus-Wirkstoff Kombinationen in spezifischer Art verändert werden und dass weitere Modulation dieser Mechanismen zu erhöhter Zelltötung in Virus-Equol kombinationsbehandelten PC-3 und 22Rv1 Zellen führt. Diese Beobachtung ist ein Anzeichen dass Autophagie möglicherweise zu dem

Zusammenfassung (Englisch)

Summary

This thesis investigates the effects of the phytochemical Equol and the chemotherapeutic agent Docetaxel in combination with the Adenovirus deletion mutant Addeltadelta and the according wildtype virus in androgen-insensitive PC-3 and androgen-responsive 22Rv1 prostate cancer cells, focusing on macroautophagy (herein referred to as autophagy; cellular process of “self-eating”) and apoptosis (cellular process of “self-killing”)-related mechanisms. The cell lines used were chosen because of their dissimilarity which reflect early and late stages of prostate cancer.

Previous research indicates that Addeltadelta synergizes with Equol and Docetaxel to promote strongly enhanced cell killing, and this could be verified in this project by several cell viability assays.

Furthermore, the modulation of autophagy related processes by each agent alone and by the combinations was investigated. Adwt, Ad?? and Docetaxel and to a weaker extent also Equol increase LC3B-II protein levels, an autophagic marker that directly correlates with the amount of autophagosomes in a cell. As LC3B-II either accumulates when autophagy is induced or when autophagy is impaired at a later stage, p62 – an adapter protein that links autophagic cargo to the autophagosome membrane and is then degraded with the cargo - protein levels were measured. The single agents mostly showed an increase in p62 levels at 48 hrs timepoints, which indicates impaired autophagic flux.

In cells treated with synergistically interacting combinations of the viruses Adwt or Addeltadelta with the drugs Equol or Docetaxel, LC3B-II levels strongly increase and a p62 decrease compared to the single agents can be observed. This observation confirms that autophagy related processes are specifically modulated in the synergistic combination treatments.

The mechanism of enhanced cell killing was demonstrated to be different in the 2 cell lines used. 22Rv1 cells showed enhanced apoptosis (measured indirectly by cleaved PARP Western blot) in response to the combination treatments compared to the effects of the single agents alone whereas PC-3 cells did not manifesting these changes. Further investigation of cell death mechanisms like necroptosis, a regulated form of necrosis and the involvement of the Bcl-2 family proteins, which are able to modulate both apoptosis and autophagy, did not lead to conclusive results and more in-depth studies are necessary to determine the nature of the additional cell killing in PC-3 cells.

Last but not least, modulation of autophagy-related mechanisms greatly enhances cell killing (measured by cell viability assay) of Addeltadelta or Adwt together with Equol in both cell lines, but according effects cannot be seen in combination with Docetaxel. Furthermore, these decreases in cell viability do not affect cleaved PARP levels in 22Rv1 cells, which indicates that they are not mediated by caspase-dependent mechanisms. Altogether, these findings indicate that autophagy modulation by Addeltadelta or Adwt combined with Equol might play an important role in the synergistic cell killing by this combination, but the modulation of those 2 processes and there connection in this setting still has to be further investigated.

Overall, these results show that autophagy-related pathways are modulated by the single treatments and the combinations in a specific manner and that further modulation of these mechanisms is connected to enhanced cell killing in Virus and Equol combination treated PC-3 and 22Rv1 cells. This observation is an indication that autophagy might contribute to the cell killing in Virus and Equol treated cells and points the way to promising future investigations.

Statistik
Das PDF-Dokument wurde 0 mal heruntergeladen.