Titelaufnahme

Titel
Klonieren und Austesten eines polycistronischen Vektors für Knochenregeneration
Weitere Titel
Cloning and testing of a polycistronic vector for bone regeneration
AutorInnenBecksteiner, Nina
Erschienen2013
Datum der AbgabeJuli 2013
SpracheDeutsch
DokumenttypBachelorarbeit
Schlagwörter (DE)Herpes Simplex Virus / VP22 / Dlx5 / Knochenregeneration / Osteogenese
Schlagwörter (EN)Herpes Simplex Virus / VP22 / Dlx5 / bone regeneration / osteogenese
Zugriffsbeschränkung
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Klassifikation
Zusammenfassung (Deutsch)

Gentherapie stellt eine Methode dar, um exogene DNA in Zellen in vitro oder in vivo einzubringen. Erhöhung oder Beschleunigung regenerativer Eigenschaften von Zellen und Gewebe kann durch Einbringung von Wachstumsfaktoren kodierender DNA und daraus folgender Differenzierung der Zellen erreicht werden. Jedoch stellt die ineffiziente Transfektion nicht-viraler Transfektionssystem eine bedeutende Limitierung dar. Die Transfektionseffizienz kann durch folgende Maßnahmen erhöht werden: Zum einen durch die Einbringung von Shuttle-Systemen, die gezielt den Gentransfer erhöhen und zum anderen durch gesteigerte post-transfektionale Effekte, die geringe Gentransfer-Effizienzen kompensieren können. Für letzteres wurde ein System entwickelt, wodurch in Zielzellen exprimierte Transkriptionsverfahren durch die Fusionierung einer viralen Domäne segregierende Eigenschaften erhalten sollten. VP22, ein Tegumentprotein des Herpes Simplex Virus 1, zeigte in zahlreichen Experimenten durch Fusion an ein Gen eine verstärkte Ausbreitung des Gens in umliegende Zellen. Aus diesem Grund ist VP22 ein attraktiver Kandidat für ein neues zelluläres Transportsystem. Einige Studien verzeichneten einen schnellen und effizienten Transport von VP22 durch die Zellmembran direkt in den Kern und Bindung an das Chromatin. Diese Transportfähigkeit macht das Virusprotein VP22 zu einem vielversprechenden Mittel für Transkriptionsfaktoren, um geringe Transduktionsraten in der Gentherapie zu überwinden. In folgender Bachelorarbeit wurde die Transfektion des Proteins Dlx5, welches ein bedeutender Transkriptionsfaktor in der durch BMP2 induzierten Osteoblastendifferenzierung ist, fusioniert mit VP22 in vitro evaluiert und mit einer Überexpression von nur Dlx5 als Kontrolle verglichen. Eine Fusionierung von Dlx5 an VP22 und anschließende Transfektion in C2C12 Zellen sollte die prämyoblastischen Vorläuferzellen in ihrer osteogenen Differenzierung unterstützen. Dazu wurden zwei verschiedene eukaryotische Expressionsvektoren unter dem konstitutiv aktiven viralen Promoter CMV (Dlx5, VP22-Dlx5) kloniert. In vitro Tests zeigten nach Transfektion mit VPplusDlx5 keine osteogene Differenzierung der Zellen, wofür die Gründe in einer inkorrekten Faltung von Dlx5 durch Fusion an VP22 zu finden sein könnten. Der klonierte Vektor VPplusDlx5 war somit nicht funktionell.

Zusammenfassung (Englisch)

Gene therapy is a method to transfer genetic material into cells either with viral or non-viral delivery systems, respectively. Therapeutic effects can be achieved by importing exogenous transcription factors, which is followed by a differentiation of the cells, depending on the bioactivity and type of factor. A significant limitation of the important imported DNA is its inability to self-amplify in vivo. By either N-terminal or C-terminal fusion of VP22, a tegument protein of the herpes simplex virus 1, an increased spreading of this protein was shown previously in numerous experiments. Therefore, VP22 is an attractive candidate for a new cellular transport system. Some studies observed a fast and efficient transport of VP22 into the nucleus and binding to the chromatin. This ability of transport reveals VP22 as an auspicious instrument to overcome low transfection rates in gene therapy. In the following bachelor thesis an overexpression of the protein Dlx5, which is an important transcription factor in the through BMP2 induced differentiation to osteoblast cells, N-terminally fused to VP22 was evaluated. The fusion of Dlx5 to VP22 and the subsequent transfection should convert the premyoblastic precursor cells into osteoblasts, or at least increase the osteogenic potency of simultaneously added recombinant human BMP2. For that purpose, two differentiate vectors were cloned – one of the vector contained Dlx5 and the other both Dlx5 and VP22, respectively. In vitro tests showed no osteogenic differentiation after the transfection. The reason could be an incorrect folding of Dlx5 because of the fusion to VP22. Therefore the cloned vector VPplusDlx5 was not functional.

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