Titelaufnahme

Titel
CFTR-Mutationsanalyse mittels konventioneller Sanger-Sequenzierung und Next-Generation Sequencing
Weitere Titel
CFTR mutation analysis using conventional Sanger sequencing and Next-generation sequencing
AutorInnenLiebmann-Reindl, Sandra
GutachterPrevedel, Christine
Erschienen2012
Datum der AbgabeJuni 2012
SpracheDeutsch
DokumenttypBachelorarbeit
Schlagwörter (DE)Cystische Fibrose / CFTR-Mutationsanalyse / Next-Generation Sequencing / Sanger Methode / Multiplex-PCR
Schlagwörter (EN)Cystic fibrosis / CFTR mutation analysis / Next-generation sequencing / Sanger method / Multiplex-PCR
Zugriffsbeschränkung
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Klassifikation
Zusammenfassung (Deutsch)

Hintergrund: Cystische Fibrose (CF), oder auch Mukoviszidose genannt, ist eine der häufigsten angeborenen Stoffwechselerkrankung, die autosomal-rezessiv vererbt wird und auf diverse Mutationen im „Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator“ (CFTR)-Gen zurückzuführen ist. Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Anwendung der Next-Generation Sequencing Technologie auf dem Gebiet der CFTR-Mutationsanalyse. In den vergangenen Jahrzehnten galt die Sanger-Sequenzierung als Goldstandard für die DNA-Sequenzierung, doch seit der Einführung der ersten kommerziell erhältlichen Next-Generation Sequencing (NGS)-Plattform gewinnt diese Technologie zunehmend an Bedeutung auf dem Gebiet der genetischen Analyse.

Methoden: Das Ziel dieser Studie war der direkte Vergleich der zwei Sequenziermethoden, einerseits der konventionellen, kapillaren Sanger-Sequenzierung und andererseits der Next-Generation Sequencing (NGS) 454 Pyrosequenzierungstechnologie. Zu Beginn wurden die jeweiligen CFTR Exons durch die exonspezifische PCR und zusätzlich ausgewählte PatientInnen mit dem MASTR® Assay Multiplex Kit amplifiziert. Nach der Reinigung wurden die PCR-Produkte direkt entweder mit dem Genetic Analyzer 3130 oder GS Junior© 454 sequenziert. Mit Hilfe eines 20 PatientInnen umfassenden Kollektivs wurde die Performance dieser beiden Sequenziermethoden hinsichtlich der Detektierbarkeit der zu verifizierenden Mutationen untersucht.

Ergebnisse: In dieser Studie wurden insgesamt 23 Mutationen mittels Sanger-Sequenzierung und Next-Generation Sequencing identifiziert. 9 Mutationen konnten durch das Next-Generation Sequencing aufgrund von Qualitätsproblemen mit der eingesetzten Patienten-DNA und sequenzspezifischen Schwierigkeiten innerhalb der Sequenzierungsreaktion nicht identifiziert werden. Trotzdem zeigt der Methodenvergleich deutlich, dass kein signifikanter Unterschied besteht und daher das Next-Generation Sequencing eine praktikable Alternative zur konventionellen Sanger-Sequenzierung darstellt. Zusätzlich zeigten die Ergebnisse der Exon-spezifischen im Vergleich zur Multiplex-PCR Methode Unterschiede bezüglich der erreichten Mutationsdetektionsrate, dennoch wurde keine Signifikanz aufgrund der geringen Größe des Patientenkollektivs erreicht.

Schlussfolgerung: Das Ziel der Studie, die Performance der NGS-Technologie im Anwendungsgebiet der CFTR-Mutationsanalyse im Vergleich zur konventionell verwendeten Sanger-Sequenzierung darzustellen, konnte erreicht werden. Der Datenvergleich zeigte, dass das Next-Generation Sequencing eine schnelle und kostengünstige diagnostische Möglichkeit zur Identifizierung von Sequenzvariationen ist und gleichzeitig hochsensitive, genaue Ergebnisse liefert.

Zusammenfassung (Englisch)

Background: Cystic Fibrosis (CF) is one of the most common autosomal-recessive disorders among Caucasians caused by different mutations in the “Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator” (CFTR) gene. This thesis deals with the utility of Next-Generation sequencing in the field of CFTR-mutation analysis. During the past decades Sanger Sequencing has been gold standard for DNA Sequencing. Since the launch of the first commercially available Next-Generation Sequencing (NGS) platform this technology gains impact on genetic mutation analysis and is rapidly changing the landscape of genetics.

Methods: The aim of this study was the direct comparison of two sequencing methods using either conventionally capillary based Sanger Sequencing or Next-Generation Sequencing (NGS) 454 pyrosequencing technology. CFTR exons were amplified using exonspecific PCR and additionally selected patients with MASTR® Assay Multiplex Kit. After purification the PCR products were directly sequenced using either Genetic Analyzer 3130 or GS Junior© 454. With a total of 20 patients the performance of these two sequencing methods was evaluated for their ability of mutation detection.

Results: A total of 23 mutations were identified by Sanger Sequencing and Next-Generation Sequencing. There have been 9 undetected mutations in both methods due to quality problems of the initial DNA and sequence specific difficulties within the sequencing reaction. Nevertheless the comparison of the methods clearly showed there is no significant difference between the results of Sanger-Sequencing and Next-Generation Sequencing and therefore the new method seems to be an efficient alternative to conventional dideoxysequencing method. Additionally the results of exon specific and multiplex PCR showed differences in mutation detection rate, there was no significance due to the small size of the patients collective.

Conclusion: We managed to achieve the aim of the study, which was to elucidate the performance of NGS technology concerning CFTR mutation analysis in comparison to the conventionally used Sanger-Sequencing. The data comparison indicates that Next-Generation sequencing is a rapid and cost-effective diagnostic tool for sequence variation identification and simultaneously provides accurate high sensitive sequencing results.

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