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Title
Genetische Modifikationen von spannungsgesteuerten Kalium Kanälen der Kv7 Familie
Additional Titles
Genetic Modification Of Voltage-Gated Potassium Channels Of The Kv7 Family
AuthorGraf, Yvonne
Published2015
Date of SubmissionJuly 2015
LanguageGerman
Document typeBachelor Thesis
Keywords (DE)KCNQ / Kv7 / Kalium Kanäle / gerichtete Mutagenese / Cystein / Alanin / Fluoreszenz-Tags / Paracetamol / TIRF
Keywords (EN)KCNQ / Kv7 / Potassium Channels / Site-Directed-Mutagenese / Cystein / Alanin / Fluorescence-Tags / Paracetamol / TIRF
Restriction-Information
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Classification
Abstract (German)

In der folgenden Arbeit werden genetische Modifikationen an neuronalen Kv7 Kalium Kanälen beschrieben. Die KCNQ-Gene kodieren für 5 verschiedene Mitglieder der Untereinheiten, die die Tetramere dieser membranständigen K+ Kanäle aufbauen.

Durch gerichtete Mutagenese mit Hilfe von PCR wurden konservierte Cysteine der Kv7.2 Isofrom 4, Kv7.3 und Kv7.5 durch Alanine ersetzt. Die Positionen der Cysteine im Kv7.2 Isoform 4 sind C106, C150, C151, C152, C169 und C492 (und äquivalente Positionen in den anderen Subtypen). Die Auswirkungen der Mutationen auf den Effekt von N-acetyl-p-benzoquinoneimin auf die Kv7 Kanäle werden in weiterführenden Untersuchungen mit elektrophysiologischen Methoden analysiert. Bei dieser Substanz handelt es sich um ein toxisches Abbauprodukt des Schmerzmittels Paracetamol. Eine weiter genetische Veränderung, die an den Kanalproteinen vorgenommen wurde, war das n-terminale Taggen der Wildtyp-DNA mit Fluoreszenzprotein. Dies erfolgte durch die Klonierung der KCNQ-Gene in einen Expressionsvektor, der EYFP, ECFP, mCherry oder mGFP enthält.

Alle Mutationen konnten erfolgreich in den Expressionsplasmiden der drei Mitglieder der Kv7 etabliert werden. Bei den n-terminal getaggten Kanalproteinen hat die Klonierung außer bei den Kv7.3-mCherry-C1 und Kv7.3-EYFP-C1 Konstrukten funktioniert.

Abstract (English)

The following paper discusses genetic modification of neuronal Kv7 potassium channels. KCNQ genes encode for 5 different subunits which form the tetramers of membranous Kv7 channels.

By using site-directed mutagenesis, via PCR, conserved cysteine residues of Kv7.2 isoform 4, Kv7.3 and Kv7.5 were replaced with alanine residues. The positions of the cysteine in Kv7.2 isoform 4 are C106, C150, C151, C152, C169 and C492 (with equivalent positions in the other subtypes). The impact of the mutations on the effect of N-acetyl-p-benzoquinoneimin on the Kv7 channels are analysed in further studies using electrophysiological methods. This substance is a metabolite of the analgesic drug paracetamol. A further genetic modification of the channel proteins was introducing N-terminal fluorescence tags to the wild-type DNA. This was accomplished by cloning the KCNQ genes into an expression vector which contains EYFP, ECFP, mCherry or mGFP.

All mutations were successfully established in the expression plasmids of the three Kv7 members. The cloning of N-terminally tagged channel proteins has been a success except for the Kv7.3-pmCherry-C1 and Kv7.3-EYFP-C1 constructs.