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Title
Molekulare Charakterisierung von der C-Raf - Rock2 Interaktion
Additional Titles
Molecular Details of the C-Raf - Rock2 Interaction
AuthorSchuh, Carina Maria
Published2014
Date of SubmissionJuly 2014
LanguageEnglish
Document typeBachelor Thesis
Keywords (DE)C-Raf – Rock2 Interaktion / Kinase Domäne / regulatorische Domäne / Phospho-Reste / Überexpression / endogenen Proteine / mutierte Proteine
Keywords (EN)C-Raf – Rock2 interaction / kinase domain / regulatory domain / phosphorylation sites / overexpression / endogenous proteins / mutant proteins
Restriction-Information
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Classification
Abstract (German)

C-Raf spielt eine wesentliche Rolle bei Ras-vermittelten epidermalen Tumoren. Diese Funktion wird durch die direkte Bindung und durch die Hemmung der Aktivität der Zytoskelettkinase Rock2 ausgeübt. Die Hemmung dieser Interaktion kann bei der Therapie solcher Tumore helfen. Deshalb wurde die Interaktion dieser Proteine näher erforscht. Es wurde herausgefunden, je länger C-Raf ist, desto stärker bindet C-Raf an Rock2. Trunkierungsstudien vom C-terminus ausgehend zeigten, dass die Anwesenheit des N-terminalen kleinen Lappens der C-Raf Kinase Domäne die Bindung der regulatorischen Domäne von Rock2 erhöht. Von der Trunkierung des N-terminus war absehbar, dass die vorhergesagte erste Helix zur Bindung von C-Raf mit Rock2 beiträgt. Da die N-terminale unstrukturierte Region, welche regulatorische Phospho-Reste von C-Raf beinhaltet, möglicherweise wichtig ist, wurde die Rolle der Phospho-Reste auch überprüft. Aus den Überexpressionsstudien und den durchgeführten Experimenten mit endogenen Proteinen geht klar hervor, dass der Rest S259, welcher eine Rolle beim Öffnen des C-Raf Konstrukts mit EGF Stimulierung spielt, im C-Raf - Rock2 Komplex dephosphoryliert ist. Die anderen regulatorischen Phospho-Reste (S43, S338 und S289/296/301) sind im Komplex phosphoryliert, obwohl sie in der Co-Immunoprezipitation nicht angereichert sind. Dies befindet sich im Einklang mit den Resultaten bei denen mutierte Proteine verwendet wurden, um die Phosphorylierung dieser Reste zu beseitigen. Außer bei S259A wurde keine drastische Reduktion der Komplexbildung durch die Mutation (der Reste S29, S43, S338 und S289/296/301) festgestellt. Demzufolge, muss C-Raf sich in einer offenen Konformation für die Raf - Rock Interaktion befinden und die Interaktion ist nur durch die Phosphorylierung von S259 vermindert.

Abstract (English)

C-Raf is essential for the maintenance of Ras-driven epidermal tumors. It can exert this function via directly binding and inhibiting the activity of the cytoskeletal kinase Rock2. The inhibition of this interaction could help in the therapy of such tumors. Therefore the interaction of the proteins was studied in more detail. It is found that the longer the C-Raf, the stronger binds C-Raf to Rock2. From C-terminal truncation studies it is shown that the presence of the N-terminal small lobe of the C-Raf kinase domain improves the binding of the regulatory domain to Rock2. From N-terminal truncation it is also conceivable that the predicted first helix contributes to the binding of C-Raf to Rock2 as well. Since the N-terminal unstructured region, which contains regulatory phosphorylation sites in C-Raf, may be important, the role of these possible phosphorylation sites was also investigated. It is clear from overexpression studies and from the experiment carried out with endogenous proteins that the site S259, which has a role opening up the structure of C-Raf upon EGF stimulation, is dephosphorylated in the C-Raf - Rock2 complex. The other regulatory phosphorylation sites (S43, S338 and S289/296/301) are phosphorylated in the complex, although they are not enriched in the co-immunoprecipitation. This is in line with the findings using mutant proteins to abolish phosphorylation of these sites that except for the S259A, no drastic decrease was detected on complex formation upon mutation (of S29, S43, S338 and S289/296/301 sites). Accordingly, C-Raf has to be in an open conformation for the Raf - Rock interaction and the interaction is diminished only by the phosphorylation of S259.

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