Titelaufnahme

Titel
Analyse des allergenen Potentials von Fischallergenmutanten und Evaluierung ihrer therapeutischen Anwendbarkeit
Weitere Titel
Analysis of Allergenic Potential of Fish Allergen Mutants and Evaluation of their Therapeutic Applicability
VerfasserSlowacek, Iris
Erschienen2012
Datum der AbgabeJuli 2012
SpracheDeutsch
DokumenttypBachelorarbeit
Schlagwörter (DE)Schlagwörter: / Fischallergie / Parvalbumin / Rekombinante Allergene / Hypoallergene Derivate / Spezifische Immuntherapie
Schlagwörter (EN)Key words: / Fish allergy / Parvalbumin / Recombinant allergens / Hypoallergenic derivatives / Specific immunotherapy
Zugriffsbeschränkung
 _
Klassifikation
Zusammenfassung (Deutsch)

Analyse des allergenen Potentials von Fischallergenmutanten

und Evaluierung ihrer therapeutischen Anwendbarkeit

Bei der Anwendung der spezifischen Immuntherapie an einem an Nahrungsmittelallergie erkrankten Patienten, besteht ein deutlich erhöhtes Risiko anaphylaktische Nebenwirkungen auszulösen.

Daher versuchten Forscher einen Weg zu finden, Fischallergiker auf eine weniger gefährliche Art zu desensibilisieren. Dieses Vorhaben gelang ihnen durch die Erzeugung eines hypoallergenen Derivates des Hauptfischallergens, Parvalbumin, in welchem durch gezielte Mutationen in den kalziumbindenden Domänen die Allergenizität stark reduziert worden war. Diese Punktmutationen dienten dazu, die erste und dritte Aminosäure der kalziumbindenden Schleife (beides Asparaginsäure) durch unpolares Alanin zu ersetzen.

Ziel des Praktikums war es nun, herauszufinden, ob das Einführen von analogen Punktmutationen in Thunfisch und Karpfen Parvalbumin auch zu Hypoallergenizität führen würde und die so generierten Mutanten ebenfalls Kandidaten für eine sichere, nebenwirkungsfreie spezifische Immuntherapie darstellen könnten.

In die im Labor bereits vorhandenen Konstrukte von Wildtyp Thunfisch Parvalbumin (Thu a 1 WT), Wildtyp Kabeljau Parvalbumin (Gad c 1 WT) und deren Mutanten (Thu a 1 Mut und Gad c 1 Mut) wurde mittels PCR ein His – Tag eingeführt. Die Polymerase – Kettenreaktion wurde dabei zwei Mal durchgeführt, einmal mit der Taq- und einmal mit der Pfu – Polymerase, um zu beweisen, dass die Taq – Polymerase fehleranfälliger ist als die Pfu – Polymerase.

Es folgte die Klonierung der Produkte in den bakteriellen Expressionsvektor pET – 17b. Im Anschluss wurden die Proben zur Sequenzierung geschickt und ein Homologievergleich der DNA- und Aminosäuresequenz der eigenen Proben und Originalkonstrukte durchgeführt.

Die Aminosäureabfolge war in sämtlichen Proben unverändert geblieben, die DNA – Sequenz jedoch nicht. Die beiden Kabeljauproben Gad c 1 WT (B5) und Gad c 1 Mut (B6), welche beide durch die Pfu – Polymerase amplifiziert worden waren, wiesen einen Fehler von 1 bp auf. Dieser hatte jedoch keine Auswirkung auf ursprünglich codierte Aminosäure (Alanin) und war deswegen vernachlässigbar.

Nach der Proteinexpression im E. coli – Stamm BL21(DE3), wurden die Proben durch eine Ni – NTA – Säule aufgereinigt und dialysiert. Es erfolgte die Bestimmung der Proteinkonzentration nach Bradford und im Anschluss wurden zwei verschiedene Western Blots durchgeführt, welche einmal chromogen und einmal chemilumineszent detektiert wurden.

Die Resultate der Western Blots zeigten, dass die Parvalbuminmutanten des Thunfisches und Kabeljaus ebenfalls für die spezifische Immuntherapie verwendet werden können, da die IgE – Reaktivität in beiden Fällen stark reduziert war.

Zusammenfassung (Englisch)

Analysis of allergenic potential of fish allergen mutants

and evaluation of their therapeutic applicability

In case of choosing specific immunotherapy as treatment for a patient suffering from food allergy, the risk of anaphylactic side effects rises dramatically. Therefore researchers tried to find a method to treat fish allergy in a safer way. They succeeded in producing a hypoallergenic derivative of the main fish allergen, parvalbumin, which showed a significantly lowered IgE-reactivity caused by site-directed mutagenesis in the calcium – binding regions.

Through these point mutations the first and third amino acid of the calcium – binding loop (both aspartic acid) were switched with a nonpolar alanine.

The aim of the internship was, to find out, if the insertion of analogue point mutations into tuna and cod parvalbumin, also led to hypoallergenicity and if the generated derivatives could therefore also be used for specific immunotherapy.

To the wild – type tuna parvalbumin (Thu a 1 WT), wild – type cod parvalbumin (Gad c 1 WT) and their mutants (Thu a 1 Mut and Gad c 1 Mut), which were already present in the lab, a His – Tag was added through PCR. The polymerase chain reaction was conducted two times, once with the Taq- and once with the Pfu – polymerase, to show that the Taq – polymerase error – prone than the Pfu – polymerase.

Afterwards the products were cloned into the bacterial expression vector pET – 17b. Then the samples were sent for sequencing and homology comparisons of DNA- and amino acid sequences between the own and the original constructs were conducted. The primary structure of the protein was unchanged, whereas there was a one base pair difference in the DNA – sequence of the two cod samples, Gad c 1 WT (B5) and Gad c 1 Mut (B6), that had been amplificated with the Pfu – polymerase. This 1 bp – difference was deemed insignificant, because the original amino acid (alanine) stayed the same.

After the proteins were expressed in the E. coli – strand BL21(DE3), the proteins were purified by Ni – NTA – columns and dialysed.

The purification was followed by the determination of protein concentration (Bradford) and after that two Western Blots were conducted, one by chromogenic and the second by chemiluminescent detection.

The Western Blots showed that the IgE – reactivity of the mutants was drastically reduced and that the proteins could therefore be used for specific immunotherapy.